羅　樂(lè)，趙　碧，鄭　敏，吳良濤，文　明,2

(1. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)　550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)　550025)

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鴨源PKC基因熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

羅樂(lè)1，趙碧1，鄭敏1，吳良濤1，文明1,2

(1. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng)550025)

摘要為建立基于鴨源宿主細(xì)胞的蛋白激酶PKC基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的PKC基因設(shè)計(jì)、合成特異性引物，通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒GV pXT19-T-PKC，并以其為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品建立熒光定量PCR檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行重復(fù)性、特異性和敏感性驗(yàn)證。結(jié)果顯示，熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.334 0x+44.199，相關(guān)系數(shù)為0.995 4，擴(kuò)增效率為99.19%；熔解曲線僅出現(xiàn)單特異峰，未檢測(cè)到H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒等參考毒株的核酸樣本的熒光信號(hào)。說(shuō)明，建立的熒光定量PCR方法具有良好的穩(wěn)定性、特異性和靈敏性。

關(guān)鍵詞實(shí)時(shí)熒光 PCR；蛋白激酶C；SYBR Green Ⅰ

鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)是阻礙水禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要病原之一[1]。目前，對(duì)該病毒的研究雖然取得多方面進(jìn)展，但其致病機(jī)制尚未完全清楚。該病毒主要通過(guò)與宿主相互作用而致病，但有關(guān)宿主細(xì)胞對(duì)DEV感染的應(yīng)答，尤其是病毒蛋白受體的研究較少。貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究室在前期研究中通過(guò)構(gòu)建DEV基因文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)并鑒定核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein，NP)[2]，隨后通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選并鑒定核衣殼蛋白在鴨宿主細(xì)胞的受體為蛋白激酶C抑制蛋白(Protein kinase C inhibitor，PKCI)[3]。

PKCI是PKC在宿主細(xì)胞內(nèi)的抑制蛋白質(zhì)，也是DEV在宿主細(xì)胞內(nèi)的受體。有研究表明，蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)是一類由多基因編碼，分子質(zhì)量約80 ku的多肽類物質(zhì)，屬于Ser/Thr蛋白激酶家族，參與細(xì)胞內(nèi)多種功能的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如增殖、分化和凋亡等。有學(xué)者在研究禽流感病毒[4]、新城疫病毒[5]和博納病病毒[6]時(shí)發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞的蛋白激酶與病毒增殖存在一定關(guān)系，即宿主細(xì)胞的蛋白激酶通過(guò)調(diào)節(jié)病毒蛋白的磷酸化，影響病毒蛋白分布，進(jìn)而改變病毒的復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程，但PKCI通過(guò)PKC影響DEV增殖的機(jī)制尚不清楚。由于實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)是當(dāng)前分析基因表達(dá)差異的重要方法，具有實(shí)時(shí)性、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性和靈敏度高等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[7]。因此，有必要建立針對(duì)鴨源PKC基因的FQ-PCR檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究闡明PKCI及PKC對(duì)DEV增殖影響的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1毒株與細(xì)胞

鴨腸炎病毒GZ株(DEV-GZ)，由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。鴨胚成纖維細(xì)胞，由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)傳統(tǒng)方法制備。

1.2主要試劑

E.coliDH5α，由貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供；克隆載體 pMD19-T Vector、膠回收試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)和MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒等，均購(gòu)自TaKaRa 公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖蠩. Z. N. A.TMPlasmid Mini Kit，購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.3引物設(shè)計(jì)與cDNA合成

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的PKC基因mRNA序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PKC基因引物，PKCF：5′-AAAGGATAATGTGGGGTAT-3′；PKCR：5′-TGAAAGACACTGGTGACAC-3′。預(yù)擴(kuò)增片段大小為213 bp，由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

采用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取鴨肝臟組織總RNA，并以此為模板，通過(guò)PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，保存，待用。

1.4PKC標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

1.4.1目的基因擴(kuò)增與回收采用常規(guī) PCR 方法擴(kuò)增PKC基因。反應(yīng)體系：1.0 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，2.5 μL 2×TaqPCR Master Mix反應(yīng)液，ddH2O補(bǔ)至25.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，回收PCR 產(chǎn)物。

1.4.2重組質(zhì)粒構(gòu)建將回收的目的產(chǎn)物連接至PMD-19T載體，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α，采用含氨芐西林的LB瓊脂平板，通過(guò)藍(lán)白斑篩選出白色菌落進(jìn)行大量培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒GV pXT19-T-PKC，經(jīng)雙酶切和測(cè)序鑒定后，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒GV pXT19-T-PKC作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的OD260和OD280，計(jì)算重組質(zhì)粒的DNA濃度，并計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)：拷貝數(shù)=(6.02×1023×質(zhì)粒DNA濃度)/(DNA長(zhǎng)×109×660)。

熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取陽(yáng)性重組質(zhì)粒作10倍梯度稀釋，以不同稀釋度陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，通過(guò)熒光定量PCR儀測(cè)定Ct值。以起始拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)(x)，Ct值為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6重復(fù)性驗(yàn)證

取1 μL拷貝數(shù)為3.52×103～3.52×1010的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行3次PCR檢測(cè)，根據(jù)Ct值驗(yàn)證其重復(fù)性。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.7敏感性驗(yàn)證

分別以1 μL拷貝數(shù)為3.52×100～3.52×101的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒和1 μL拷貝數(shù)為3.52×103～3.52×107的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，驗(yàn)證該方法的敏感性。單位體積拷貝數(shù)越小，敏感性越好。PCR反應(yīng)條件同“1.6”。

1.8特異性驗(yàn)證

選擇H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒為參考毒株，提取參考毒株的核酸，驗(yàn)證建立的熒光定量PCR方法的特異性。

2結(jié)果與分析

2.1PKC標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒的制備

2.1.1目的基因擴(kuò)增采用引物 PKCF/PKCR，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到213 bp的目的條帶，與理論擴(kuò)增片段大小一致(圖1)，說(shuō)明已成功擴(kuò)增獲得目的基因。

M. DGL2000 Marker；1.PKC基因擴(kuò)增產(chǎn)物PKCgene amplified product

圖1目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.1Result of target gene amplification

2.1.2菌落PCR鑒定藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)后，挑取10個(gè)白色菌落，以載體引物M13-47/M13-48為菌落引物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，挑取的菌落為陽(yáng)性(圖2)，說(shuō)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成功。

2.1.3質(zhì)粒PCR鑒定提取構(gòu)建質(zhì)粒并進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得1條213 bp的目的條帶，與理論擴(kuò)增片段大小一致，說(shuō)明克隆序列與目的序列的同源性為100%(圖3)。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果分析

以1 μL拷貝數(shù)為3.52×105～3.52×1010的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，PCR的擴(kuò)增效率為99.19%，且模板Ct值(y)與起始拷貝數(shù)(x)滿足關(guān)系式：y=-3.334 0x+44.199，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3.334 0，相關(guān)系數(shù)為0.995 4(圖4)，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可推算出起始拷貝數(shù)。

M. DGL2000 Marker；1～10. 菌落PCR產(chǎn)物PCR product ofE.coli

圖2菌落PCR鑒定結(jié)果

Fig.2Screen PCR results

M. DGL2000 Marker；1. 質(zhì)粒PCR產(chǎn)物Product of plasmid PCR

圖3質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

Fig.3PCR amplification result of plasmid

2.3重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果分析

選取1 μL拷貝數(shù)為3.52×103～3.52×1010的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板進(jìn)行3次熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，其Ct值的重復(fù)性較好，在相同起始拷貝數(shù)下，3次重復(fù)試驗(yàn)的Ct值與平均值的差值均不超過(guò)0.5(表1)，說(shuō)明建立的熒光定量PCR方法具有較好的重復(fù)性。

圖4　PKC標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

起始拷貝數(shù)InitialcopynumberCt值 Ct-value第1次First第2次Second第3次Third平均值A(chǔ)verage3.52×101010.7810.5310.5510.623.52×10914.4014.7514.5914.583.52×10817.8217.6617.6817.723.52×10720.1920.1820.3620.243.52×10625.0324.7424.8624.873.52×10527.2527.2627.1527.223.52×10429.1029.1228.8129.013.52×10335.0035.0035.0035.00

2.4特異性與敏感性驗(yàn)證結(jié)果分析

以H5亞型/H7亞型/H9亞型禽流感病毒疫苗毒株、新城疫病毒和鴨肝炎病毒等參考毒株的核酸樣本為模版進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，在參考毒株中均未檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)，且熔解曲線呈單一峰(圖5)，說(shuō)明建立的熒光定量PCR方法具有良好的特異性。以系列稀釋度陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在3.52個(gè)拷貝數(shù)模板上能檢測(cè)到擴(kuò)增信號(hào)(圖6-G)，說(shuō)明建立的熒光定量PCR方法具有較高的敏感性。

圖5　熔解曲線

A～E. 3.52×103～3.52×107拷貝數(shù)擴(kuò)增信號(hào)3.52×103-3.52×107copies amplification signal；F～G. 3.52×100～3.52×101拷貝數(shù)擴(kuò)增信號(hào)3.52×100-3.52×101copies amplification signal；H. 參考毒株Reference strains

圖6特異性與敏感性檢測(cè)

Fig.6Result of specificity and sensibility

3討 論

熒光定量PCR技術(shù)是將DNA熒光結(jié)合染料或特異性熒光探針加入PCR反應(yīng)體系，通過(guò)熒光信號(hào)強(qiáng)弱實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程的一種PCR技術(shù)[8]。常用的熒光定量PCR技術(shù)有絕對(duì)定量PCR和相對(duì)定量PCR 2種。絕對(duì)定量PCR法一般是通過(guò)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同的條件下檢測(cè)目的基因的熒光信號(hào)量，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因的絕對(duì)量[9]；而相對(duì)定量PCR方法是計(jì)算一定樣本中靶序列相對(duì)于參照基因量的變化量，再根據(jù)通過(guò)基因與參照基因的比值反映目的基因的變化[10]。目前，F(xiàn)Q-PCR方法是常用的相對(duì)定量PCR技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于家畜、家禽和水產(chǎn)動(dòng)物等病原的快速檢測(cè)，并取得較好的應(yīng)用效果[11-13]。

選擇熒光染料是建立相對(duì)定量PCR方法的關(guān)鍵。SYBR GreenⅠ熒光染料可以與雙鏈DNA特異結(jié)合，熒光信號(hào)強(qiáng)弱與PCR產(chǎn)物的量呈正相關(guān)，且應(yīng)用簡(jiǎn)便，無(wú)需設(shè)計(jì)探針，可降低檢測(cè)成本，但該熒光染料也可與非特異DNA片段結(jié)合產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，因此，在優(yōu)化反應(yīng)條件時(shí)需結(jié)合熔解曲線分析軟件檢測(cè)是否存在引物二聚體干擾。本研究選擇SYBR GreenⅠ作熒光染料，且在檢測(cè)其熔解曲線時(shí)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)過(guò)程只出現(xiàn)單一波峰，說(shuō)明建立的SYBR Green I 熒光定量PCR方法無(wú)假陽(yáng)性信號(hào)。

相關(guān)系數(shù)、斜率值和擴(kuò)增效率是衡量實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法優(yōu)劣的重要指標(biāo)。理想的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立的曲線的相關(guān)系數(shù)接近1，斜率值為-3.5～-3.0，擴(kuò)增效率為90%～110%，而本研究建立的鴨源PKC基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR方法，其曲線的相關(guān)系數(shù)為0.996 4，斜率為-3.334 0，擴(kuò)增效率為99.19%，說(shuō)明該方法達(dá)到實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)要求，可用于后續(xù)研究。

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Received 2015-07-15Returned2015-10-25

Foundation itemThe National Natural Science Foundation of China (No. 31260607,31560703); the Guizhou Youth Science and Technology Foundation (Grant No.Qiankehe Renzi[2013]25th); Guizhou Science and Technology Innovation Talents Team(Grant No.Qiankehe Talents Team[2015]4016th).

First authorLUO Le, male, master student.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:499639895@qq.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment of Real-time Fluorescence Quantitative PCR Method for DetectingPKCGene in Duck

LUO Le1, ZHAO Bi1, ZHENG Min1, WU Liangtao1and WEN Ming1,2

(1. Colleg of Animal Science, Guizhou University, Guiyang550025, China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Veterinary Public Health of Guizhou Province, Guiyang550025, China)

AbstractTo develop a SYBR GreenⅠ Real-Time PCR method assay for detecting the PKC gene in duck, the specific primers were designed and synthesized accorded to the PKC gene in the GenBank. and the target gene fragment obtained by PCR. Then the recombinant plasmid GV pXT19-T-PKC were constructed. The real-time fluorescent quantitative PCR method and the standard curve were established, then analyzed its reproducibility, specificity and sensitivity. The linear relationship of standard curve was y=-3.334 0x+44.199, and the correlation coefficient was 0.995 4, the amplification efficiency was 99.19%. There were a single specific peak appeared in the melting curve, and the fluorescence signal were not detected in the H5, H7, and H9 subtype of avian influenza virus, Newcastle disease virus and duck hepatitis virus.All the results indicated the Real-Time fluorescent quantitative PCR method for PKC gene in ducks is excellent stability, specificity and sensitivity.

Key wordsFluorescence quantitative PCR; Protein kinase C; SYBR GreenⅠ dye

Corresponding authorWEN Ming, male,Ph.D,professor.Research area:micrbiology and immunology.E-mail:as.mwen@gzu.edu.cn

中圖分類號(hào)S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1004-1389(2016)03-0342-05

通信作者：文明，男，博士，教授，從事獸醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)研究。E-mail：as.mwen@gzu.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31260607；31560703)；貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)計(jì)劃[黔科合人字(2013)25號(hào)]；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)[黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2015)4016號(hào)]。

收稿日期：2015-07-15修回日期：2015-10-25

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.008.html

第一作者：羅樂(lè)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)。E-mail：499639895@qq.com