吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽　712000)

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豬瘟疫苗毒株和流行毒株RT-nPCR檢測方法的建立

吳旭錦，朱小甫

(咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室，陜西咸陽712000)

摘要為給臨床快速鑒別診斷豬瘟提供技術(shù)依據(jù)，根據(jù)GenBank公布的CSFV全基因序列，結(jié)合豬瘟序列測定結(jié)果，針對 NS5B基因區(qū)域設(shè)計(jì)2條通用外擴(kuò)引物、2條通用內(nèi)擴(kuò)引物和1條疫苗毒株特異性內(nèi)擴(kuò)引物，建立一種可鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株的RT-nPCR診斷方法。結(jié)果顯示，該方法可從HCLV株擴(kuò)增出2條大小分別為261 bp和157 bp的片段，可從Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株擴(kuò)增出1條261 bp的片段，其他幾種常見豬病毒檢測均呈陰性；靈敏度試驗(yàn)表明，檢測的cDNA質(zhì)量濃度極限為3.4×10-7pg/L；116份臨床樣品中有37份樣品檢測呈陽性，陽性率為32%；分析部分陽性病料 E2基因序列也證實(shí)檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。說明：建立的RT-nPCR鑒別診斷方法靈敏度高、特異性好，能直觀區(qū)分豬瘟疫苗毒株和流行毒株。

關(guān)鍵詞豬瘟；反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；鑒別診斷

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是一種高度接觸性傳染病，其病原為豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)，豬和野豬是其唯一宿主[1]。關(guān)于CSF的報(bào)道最早可追溯至19世紀(jì)早期，該病一直是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的烈性傳染病，中國農(nóng)業(yè)部將其列為一類動物疫病。CSFV屬黃病毒科，瘟病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，基因組全長約12.3 kb，僅含1個大的開放閱讀框(ORF)，編碼蛋白的順序依次為NPRO、C、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B[2]。

中國學(xué)者[3-4]于20世紀(jì)50年代研制出豬瘟兔化弱毒疫苗，為控制豬瘟做出重要貢獻(xiàn)。但由于多種原因，中國至今未能消滅豬瘟，豬瘟的流行出現(xiàn)新變化，免疫失敗現(xiàn)象屢見不鮮，豬瘟癥狀非典型化、溫和型豬瘟及母豬隱性帶毒現(xiàn)象普遍。多年來，國內(nèi)常采用以疫苗預(yù)防為主的豬瘟防控策略，使豬群疫苗免疫覆蓋率高，疫苗毒株在豬群中廣泛存在，并且近幾年流行的藍(lán)耳病臨床癥狀和剖檢變化與豬瘟相似，導(dǎo)致豬瘟臨床診斷難度增大[3-4]。目前，多通過實(shí)驗(yàn)室手段診斷豬瘟，國內(nèi)常用的豬瘟診斷方法有兔體交互免疫試驗(yàn)、免疫酶染色試驗(yàn)、病毒分離與鑒定試驗(yàn)、直接免疫熒光抗體試驗(yàn)及RT-PCR技術(shù)等[5-6]，但常規(guī)熒光抗體試驗(yàn)和RT-PCR技術(shù)不能區(qū)分疫苗毒株和豬瘟流行毒株。

國內(nèi)學(xué)者嘗試建立系列的豬瘟鑒別診斷方法，如趙耘等[7]建立RT-PCR和酶切的方法以區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒與疫苗弱毒，但該技術(shù)無法確診早期感染且操作較繁瑣；趙建軍等[8]建立鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的復(fù)合熒光定量RT-PCR檢測方法，但該方法成本較高，且目前僅應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測；李艷等[9]建立鑒別豬瘟強(qiáng)毒和弱毒的RT-nPCR檢測方法，通過特異條帶大小可判斷豬瘟毒性強(qiáng)弱；謝金文等[10]建立的鑒別方法的擴(kuò)增極限為5×RID50細(xì)胞疫苗基因組拷貝，靈敏度較低，可能會造成漏診。鑒于前人研究的不足，本研究擬選取高保守 NS5B基因區(qū)域，建立一種可鑒別疫苗毒株和流行毒株的方法，不進(jìn)行測序、酶切就可以直觀區(qū)分2種毒株，以期為臨床快速鑒別診斷豬瘟提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1病 毒豬瘟病毒SXYL2006株(GenBank登錄號GQ122383)、GX54、SD2002，均由咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室采集。根據(jù)PK-15細(xì)胞傳代分離測定全基因序列，并通過基因比對證實(shí)SXYL2006株、GX54為基因Ⅱ群流行毒株，SD2002為基因Ⅰ群流行毒株。豬瘟疫苗HCLV株、藍(lán)耳毒株CH-1R、偽狂犬Bartha-K毒株疫苗，均由普萊柯生物工程股份有限公司生產(chǎn)；Shimen株、牛流行性腹瀉病毒(BVDV)、圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、細(xì)小病毒(PPV)、流行性腹瀉病毒(PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，均由咸陽業(yè)技術(shù)學(xué)院動物疫病分子生物學(xué)診斷實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2病料和血清病料和血清由陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“鑒別豬瘟疫苗株和流行毒株診斷試劑盒的研制與推廣”課題組采集或由豬場送檢，共116份。組織病料研磨處理后，12 000 r/min離心10 min，收集上清液，-70 ℃保存，備用。

1.1.3試劑TRIzol Reagent和DNAzol Reagent，均為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV反轉(zhuǎn)錄酶(10 U/ μL)、RNA酶抑制劑(40 U/ μL)、DEPC處理水、rTaq酶(5 U/ μL)、dNTP(各成分均為10 mmol/L)等，均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；DL2000 Marker，為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方 法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank公布的30多個CSFV、BVDV全基因組序列，結(jié)合陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“鑒別豬瘟疫苗株和流行毒株診斷試劑盒的研制與推廣”課題組數(shù)年研究測定的CSFV全基因序列，經(jīng)過綜合分析比對，篩選出CSFV疫苗毒株和其他流行毒株以及BVDV的差異位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)5條引物，引物序列：S1， 5′-GACACTAGYGCAGGCAAYA-3′；S2，5′-AGTGGGTTCCAGGARTAC-3′；S3，5′-CCACGGGGGTGCCCTACAA-3′；S4，5′-CCTGGCATGTAACTA-3′；S5，5′-CTCTCGGTGAG-AAATTTG-3′。預(yù)期CSFV流行毒株擴(kuò)增出1個261 bp的片段，疫苗毒株擴(kuò)增出261 bp、157 bp 兩個片段。為驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，參考文獻(xiàn)[11]合成擴(kuò)增 E2基因的2對引物P1/P2和P3/P4，引物序列：P1，5′-GTAACTGGGGCACAAGG-3′；P2，5′-TTATCACTATCAGCCACAGGACA-3′；P3，5′-TCGACAACCAATGAG-ATAGGG-3′；P4，5′-CACAGCCCAAATCCAA-AGTCATC-3′。預(yù)期擴(kuò)增 E2基因主要抗原區(qū)片段272 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，均用DEPC處理水稀釋至20 μmol/L。

1.2.2RNA的提取和第1鏈cDNA合成取HCLV株疫苗溶液250 μL，按照TRIzol Reagent試劑說明提取總RNA，倒置離心管自然干燥。在核酸干燥過程中，配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液： DEPC處理水12.5 μL，下游引物S2 1.0 μL，dNTP 2.0 μL，5×AMV Buffer 4.0 μL，AMV 0.25 μL，RNA酶抑制劑 0.25 μL，總體積20.0 μL。核酸干燥后用配制好的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液充分溶解，置42 ℃水浴反轉(zhuǎn)錄90 min，取出后通過微量紫外分光光度計(jì)測定cDNA質(zhì)量濃度。

1.2.3CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法的建立取已知質(zhì)量濃度的cDNA溶液為模板，摸索擴(kuò)增條件。第1次擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA 2.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，S1、S2各0.5 μL，改變r(jià)TaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，超純水補(bǔ)足25.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；進(jìn)入循環(huán)后94 ℃ 40 s變性，退火溫度由52 ℃至58 ℃ 按1 ℃遞增設(shè)定退火50 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取2.0 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第2次擴(kuò)增，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，S3、S4、S5各0.5 μL，改變r(jià)TaqDNA聚合酶用量(0.25～1.0 μL)和Mg2+用量(0.5～3.0 μL)，超純水補(bǔ)足25.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；進(jìn)入循環(huán)后94 ℃ 30 s變性，退火溫度由52 ℃至58 ℃按1 ℃遞增設(shè)定退火30 s，72 ℃ 延伸40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。摸索出反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的最佳組合。

1.2.4CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法靈敏性試驗(yàn)將cDNA溶液按10倍梯度稀釋至109倍，分別以稀釋后的cDNA溶液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照摸索出的最優(yōu)體系與條件進(jìn)行復(fù)合套式PCR反應(yīng)，取5.0 μL第2次擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.5CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法特異性試驗(yàn)提取HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV和PRRSV總RNA，按照建立的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄-套式復(fù)合PCR；根據(jù)DNAzol Reagent試劑說明，提取PCV-2、PRV、PPV等DNA病毒的DNA作為模板，用建立的方法做套式復(fù)合PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，成像系統(tǒng)中觀察照相。

1.2.6病料中CSFV的檢測用上述方法對收集的116份組織病料和血清進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的實(shí)用性。

1.2.7陽性病料中 E2基因擴(kuò)增與測序分析選取部分檢測陽性的病料，按照文獻(xiàn)[11]的方法擴(kuò)增 E2基因，PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)Amp篩選，挑取單個菌落，37 ℃搖動培養(yǎng)至飽和，菌液PCR鑒定為陽性，提取質(zhì)粒，BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。采用DNAstar軟件分析比較獲得序列的核苷酸和氨基酸同源性，并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，驗(yàn)證診斷方法的準(zhǔn)確性。

2結(jié)果與分析

2.1CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法的建立

通過改變反應(yīng)體系中rTaqDNA聚合酶用量和Mg2+用量，改變反應(yīng)條件中的退火溫度，優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，最終確定最優(yōu)體系和條件為：第1次擴(kuò)增cDNA 2.0 μL，超純水16.0 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL， dNTP 1.0 μL，S1、S2各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL；反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，54 ℃ 50 s，72 ℃50 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2次擴(kuò)增反應(yīng)體系和條件為：第1次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物 2.0 μL，超純水15.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Mg2+2.0 μL， dNTP 1.0 μL，S3、S4、S5各0.5 μL，rTaqDNA聚合酶0.5 μL，總體積25.0 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

2.2CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法的靈敏性

測定反轉(zhuǎn)錄第1鏈cDNA質(zhì)量濃度為3.4 pg/L，10倍梯度稀釋后進(jìn)行套式擴(kuò)增。由圖1可知，建立的方法擴(kuò)增出的可見目的條帶的最大稀釋度為107，即檢測的cDNA質(zhì)量濃度極限為3.4×10-7pg/L。說明：此方法靈敏度高，完全滿足CSFV臨床檢測需要。

M. DL2000 DNA Marker；1～10. 依次為3.4×10-1～4.0×10-7pg/L cDNA PCR結(jié)果3.4×10-1-3.4×10-7pg/L of CSFV cDNA respectively

圖1CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測靈敏度

Fig.1The result of sensitivity test of reverse

transcription-complex nested PCR for CSFV

2.3CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法的特異性

采用建立的方法對HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV、PRRSV、 PCV-2、PRV、PPV等進(jìn)行復(fù)合套式PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，HCLV株出現(xiàn)2條大小分別為261 bp、157 bp的條帶，Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002出現(xiàn)1條261 bp條帶，BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV均未出現(xiàn)條帶(圖2)?？梢姡航⒌姆椒軠?zhǔn)確擴(kuò)增CSFV基因片段，并能直觀區(qū)分疫苗株和流行毒株，即使是與HCLV同源性很高的經(jīng)典強(qiáng)毒株Shimen，也能進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，且其他常見豬源病毒均未擴(kuò)增出條帶，說明建立的方法具有較高的特異性。

2.4病料中CSFV檢測

采用建立的方法檢測116份疑似CSFV的豬肺臟、淋巴結(jié)、脾臟、肝臟、腎臟等組織以及血清等樣品。結(jié)果顯示，37份樣品呈陽性，陽性率為32%，部分病料檢測結(jié)果見圖3。

2.5陽性病料中 E2基因擴(kuò)增與測序分析驗(yàn)證

從選取的部分陽性病料中獲得11株 E2基因序列(圖4)，連續(xù)命名為SX01～SX11，將序列提交至GenBank，獲得的登錄號為KM233874～KM233884。采用DNAstar軟件比較分析獲得序列與參考序列的核苷酸和氨基酸同源性，參考毒株包括HCLV株、Shimen株以及歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室公布的已知亞型的CSFV參考毒株(AJ781111，Subgroup 1.2；AJ781096，Subgroup 1.3；AY450284，Subgroup 2.1；L36167，Subgroup 2.2；L36170，Subgroup 2.3；AF521708，Subgroup 3.2；AF24169，Subgroup 3.3；AY526731，Subgroup 3.4)。對這些毒株進(jìn)行基因分群和系統(tǒng)發(fā)生樹分析(圖5)，結(jié)果表明，11個陽性樣品的 E2基因均屬于Subgroup2.1，為近年豬瘟流行的優(yōu)勢毒株，證實(shí)建立的鑒別診斷方法是準(zhǔn)確特異的。

M. DL2000 DNA Marker；1～10.分別為HCLV、Shimen、SXYL2006、GX54、SD2002、BVDV、PRRSV、PCV-2、PRV和PPV毒株擴(kuò)增結(jié)果The result of HCLV, Shimen, SXYL2006, GX54, SD2002, BVDV, PRRSV, PCV-2, PRV and PPV respectively

圖2CSFV反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR檢測方法的特異性

Fig.2 The result of specialization test of reverse

transcription-complex nested PCR for CSFV

3討 論

迄今為止，豬瘟仍是嚴(yán)重危害中國養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病之一，早期診斷在控制豬瘟疫情中發(fā)揮重要作用。現(xiàn)行國標(biāo)GB/T16551-2008規(guī)定，豬瘟診斷技術(shù)有臨床及病理學(xué)診斷、病原學(xué)診斷和血清學(xué)診斷3個層次[12]。臨床及病理學(xué)診斷具有操作簡單、不需要儀器、現(xiàn)場即可操作的優(yōu)點(diǎn)，但該方法主觀影響大，尤其在混合感染或繼發(fā)感染等病情復(fù)雜時鑒定的準(zhǔn)確性低。豬瘟單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)可區(qū)分疫苗抗體和野毒抗體，特異性好，但靈敏度較低，且抗體產(chǎn)生較晚，不能進(jìn)行早期診斷。病原學(xué)診斷方法中，兔體交互免疫試驗(yàn)和病毒分離鑒定試驗(yàn)操作繁瑣、耗時長、檢出率較低，不適合臨床快速診斷。免疫酶染色試驗(yàn)和直接免疫熒光抗體試驗(yàn)檢測抗原操作簡便，但靈敏度較低，無法區(qū)分疫苗抗原和野毒抗原[13]。

M. DL2000 DNA Marker；P1. 疫苗陽性對照HCLV positive control；P2. Shimen毒株Shimen strain；N. 陰性對照Negative control；1～20. 部分病料檢測The detection result of some tissues

圖3部分疑似CSFV病料檢測結(jié)果

Fig.3The result of detection from some dubitable effected CSFV tissues

M. DL2000 DNA Marker； 1～6. 部分CSFV陽性病料 E2基因擴(kuò)增The result of clone E2 gene from CSFV positive tissues

圖4部分CSFV陽性病料中 E2基因擴(kuò)增結(jié)果

Fig.4The result of clone E2 gene

from CSFV positive tissues

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種擴(kuò)增CSFV特異性片段的RT-PCR方法被用于CSFV診斷。Wirz等[14]根據(jù)CSFV基因組的高保守區(qū)域序列建立RT-PCR檢測方法，與組織培養(yǎng)和免疫熒光染色法比較，該方法能更快區(qū)分CSFV。Liu等[15]建立的RT-PCR方法靈敏性可檢測到104TCID50的病毒。Sand-Vik等[16]和Goldrick等[17]建立套式RT-PCR檢測方法，其靈敏性比常規(guī)RT-PCR高1 000倍，具有檢出率高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。Risatti等[18]開發(fā)了一種可用于檢測鼻腔棉拭子中豬瘟病毒的實(shí)時RT-PCR方法，其敏感性比病毒分離高，但特異性略低。周緒斌等[19]建立復(fù)合RT-PCR方法，對BVDV和CSFV的最小檢出量達(dá)10-1TCID50。朱小甫等[11]針對 E2基因建立套式RT-PCR方法，對CSFV cDNA檢測量的最低極限為1×10-7μg/L，有靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)。張朝紅等[20]通過比較病毒分離鑒定、熒光抗體法、RT-PCR和夾心ELISA，發(fā)現(xiàn)RT-PCR檢測法具有快速、敏感等特點(diǎn)，尤其是在樣品保存不理想時也能進(jìn)行快速、高效檢測，利用套式PCR可以提高檢測的特異性。國標(biāo)GB/T16551-2008也規(guī)定檢測CSFV的套式RT-PCR方法。但以上方法均不能區(qū)分疫苗毒株和流行毒株，擴(kuò)增CSFV特異性片段后不能直接判斷是疫苗還是野毒。

圖5　基于 E2基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹

目前，公開報(bào)道的鑒別豬瘟類型的診斷方法較多，如通過RT-PCR和酶切的方法區(qū)分豬瘟強(qiáng)毒與疫苗弱毒[7]，以及通過復(fù)合熒光定量RT-PCR檢測方法鑒別豬瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株[8]等。RT-PCR配合酶切的方法操作比較費(fèi)時繁瑣，熒光定量法成本高，設(shè)備要求高，普及有一定難度。李艷等[9]建立鑒別豬瘟強(qiáng)毒和弱毒的RT-nPCR檢測方法，發(fā)現(xiàn)強(qiáng)毒時出現(xiàn)1條343 bp的特異條帶，弱毒時出現(xiàn)1條447 bp的特異條帶，檢測極限為0.04 pg，但這2個條帶大小相近，不易區(qū)分，直觀判別性不強(qiáng)。謝金文等[10]建立的鑒別方法的擴(kuò)增極限為5×RID50細(xì)胞疫苗基因組拷貝，靈敏度較低，可能會造成漏診。

鑒于前人研究的不足，本研究選取CSFV高保守基因 NS5B為靶基因，設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式PCR鑒別診斷方法。其中，S1/S2為外擴(kuò)引物，S3/S4為內(nèi)擴(kuò)通用引物，所有豬瘟病毒均可擴(kuò)增出261 bp條帶，S5為疫苗株內(nèi)擴(kuò)特異性引物，S3/S5引物組合僅豬瘟兔化弱毒株可擴(kuò)增出157 bp條帶。特異性試驗(yàn)證實(shí)，建立的方法檢測HCLV株出現(xiàn)2條大小分別為261 bp、157 bp的條帶，Shimen、SXYL2006、GX54和SD2002等流行毒株僅出現(xiàn)1條261 bp的條帶，豬群常見的幾種其他病毒的檢測結(jié)果均呈陰性，說明建立的方法能準(zhǔn)確區(qū)分疫苗株和流行毒株，即使是HCLV同源性很高的經(jīng)典強(qiáng)毒株Shimen也能準(zhǔn)確區(qū)分，且疫苗株出現(xiàn)2條條帶，流行株僅1條帶，比李艷等[9]建立的方法更為直觀，易于判斷。靈敏度試驗(yàn)表明，檢測的cDNA的質(zhì)量濃度極限為3.4×10-7pg/L，靈敏度明顯高于李艷等[9]、 謝金文等[10]的方法，完全滿足CSFV臨床檢測需要。臨床應(yīng)用檢測116份疑似CSF的組織及血清等樣品，結(jié)果有37份樣品為陽性。

由于 E2是CSFV主要保護(hù)性基因，并且在基因分群中分辨率最高，研究積累也最豐富，歐盟豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供分群參考毒株 E2基因序列，因此，為進(jìn)一步驗(yàn)證檢測方法的準(zhǔn)確性，選擇 E2基因序列進(jìn)行分析，以驗(yàn)證該方法。從檢測的陽性病料中成功獲得11株 E2基因序列，命名為SX01～SX11，GenBank登錄號為KM233874～KM233884。采用DNAstar軟件比較分析目的序列與參考序列并繪制系統(tǒng)發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)獲得的11個 E2基因序列均屬Subgroup 2.1，為近年豬瘟流行的優(yōu)勢毒株，同時證實(shí)建立的鑒別診斷方法的準(zhǔn)確性。

綜上所述，本研究建立鑒別豬瘟疫苗毒株和流行毒株的反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷方法，方法靈敏度高、特異性好，通過電泳圖像可直觀區(qū)分疫苗毒株和流行毒株，為臨床檢測提供一種有效的診斷手段。

參考文獻(xiàn)Reference：

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Received 2015-08-12Returned2015-10-26

Foundation itemThe Science and Technology Research and Development Program of Shaanxi Province (No. 2014K02-06-03); the Science and Technology Research Program of Xianyang City (No. 2014K02-21).

First author WU Xujin, female, associate professor,Ph.D.Research area:nanometer drug development and animal diseases molecular etiology.E-mail: zhuxiaofu2004@aliyun.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Establishment of a RT-nPCR Method for Detection and Differentiation of Wild-type and Vaccine Viruses of Classical Swine Fever Virus

WU Xujin and ZHU Xiaofu

(Animal Epidemic Disease Diagnostic Laboratory of Molecular Biology, Institute of Animal Husbandry and Veterinary, Xianyang Vocational Technical College, Xianyang Shaanxi712000, China)

AbstractTo establish a method of a reverse transcription-multiplex nested polymerase chain reaction for easy differentiation of classical swine fever vaccine C-strain and wild-type strains, according to the CSFV complete genome sequences in GenBank and some of the wild-type CSFV sequences in Shaanxi province, we designed two universal external expansion primers for the NS5B gene region and two universal internal primers and one special primer of expansion of C-strain, the RT-nPCR diagnostic methods were established for the identification of wild-strain CSFV and C-strain. We acquired 261 bp and 157 bp two bands from C-strain, but only acquired 261 bp band from Shimen, SXYL2006, GX54 and SD2002 other wild-strains by using the RT-nPCR method, and several other common pig virus were negative. The sensitivity test showed that the method detection limit of cDNA content was 3.4×10-7pg/L. 116 clinical samples test results showed that 37 samples were positive, the positive rate was 32%. We analyses some of E2 gene sequence of positive tissues confirmed the accuracy of the test results. The establishment of a reverse transcription-multiplex nested polymerase chain reaction method has high sensitivity, specificity, and can intuitively differentiate between C-strain and wild-strains of CSFV.

Key wordsClassical swine fever; Reverse transcription-polymerase chain reaction complex sets; Differential diagnosis

中圖分類號S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0335-07

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2014K02-06-03)；咸陽市科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃(2014K02-21)。

收稿日期：2015-08-12修回日期：2015-10-26

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.006.html

第一作者：吳旭錦，女，副教授，博士，從事納米藥物開發(fā)和動物疫病分子病原學(xué)研究。E-mail：zhuxiaofu2004@aliyun.com