吳　燕，袁海文，王　琦，岳　筠，文　明，周碧君，程振濤

(1. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴陽　550025；2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽　550025；3. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴陽　550008)

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綿羊肺炎支原體貴州株P(guān)113基因的克隆與生物信息學(xué)分析

吳燕1,2，袁海文1,2，王琦1,2，岳筠3，文明1,2，周碧君1,2，程振濤1,2

(1. 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴陽550025；2. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴陽550025；3. 貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴陽550008)

摘要為獲得綿羊肺炎支原體貴州株 P113基因生物信息學(xué)特征，應(yīng)用DNAStar、Mega 5.0、Protparam、Protscale、IEBD等工具對其(GZ-QX1株)P113蛋白特性、結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，綿羊肺炎支原體GZ-QX1株 P113基因序列大小為3 240 bp，編碼1 079個氨基酸，與綿羊肺炎支原體Y98標(biāo)準(zhǔn)株、四川SC01株、豬肺炎支原體P97、絲狀支原體山羊亞種、山羊支原體山羊亞種的核苷酸序列同源性分別為99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%。P113蛋白是分子質(zhì)量約119 ku的堿性蛋白，具有較多優(yōu)勢抗原表位；蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，P113蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)，有9個N糖基化位點，59個絲氨酸、16個蘇氨酸的磷酸化位點，14種保守的特異性蛋白質(zhì)激酶的結(jié)合位點；蛋白功能分析認為，P113可能是某信號傳導(dǎo)通路的信號分子，也是一種具有良好抗原性的結(jié)構(gòu)蛋白。

關(guān)鍵詞綿羊肺炎支原體； P113基因；生物信息學(xué)分析

綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniae，Mo)是引起山羊支原體肺炎的主要病原之一，也是目前影響?zhàn)B羊業(yè)發(fā)展的主要疫病病原[1-3]。支原體可粘附于宿主細胞表面，吸收細胞營養(yǎng)，通過細胞膜獲得膽固醇等脂質(zhì)，引起細胞損傷[4]。黏附素(Adhesin)是細菌表面的一類生物大分子，常是蛋白質(zhì)或糖蛋白，研究顯示，黏附素在支原體定殖過程中有關(guān)鍵作用[5]。黏附素亦是支原體重要的毒力因子之一，失去黏附素的支原體突變體致病作用也隨之消失[6]，因此，黏附素是支原體致病的重要因子，其與呼吸道黏膜纖毛的特異性黏附是引起肺炎的首要條件[7-8]。P113蛋白是Mo的一種重要黏附素和膜表面蛋白[9]，是研究綿羊肺炎支原體致病性、基因工程疫苗、診斷試劑的重要靶蛋白。因此，本研究對Mo貴州分離株 P113基因進行體外擴增、克隆與測序，并對推導(dǎo)氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析，以期為該蛋白體外表達可行性、蛋白應(yīng)用可行性及致病性研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1菌株Mo Y98標(biāo)準(zhǔn)株購自ATCC(29419TM)，Mo貴州流行株(GZ-QX1株)由貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室分離并保存。

1.1.2主要試劑支原體基因組小量提取試劑盒購自Biomiga公司，2×TaqPCR MasterMix、200 bp DNA Marker 購自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T載體購自TaKaRa公司，E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit 膠回收、E.Z.N.A.TMPlasmid Kit 質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)mega公司，DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ均購自Thermo公司。

1.2方 法

1.2.1 P113基因克隆測序按照支原體基因組小量提取試劑盒說明書分別提取Y98標(biāo)準(zhǔn)株和Mo貴州流行株總DNA，參考GenBank登錄的 SC01基因序列，設(shè)計合成 P113基因的分段引物(表1)進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行目的基因回收與純化，目的基因與pMD-19T載體連接轉(zhuǎn)化宿主菌，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒送至英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測序。

表1　試驗所用引物信息

1.2.2Mo P113測序基因拼接和序列分析采用DNAStar 和Mega 5.0軟件對Mo貴州流行株 P113基因序列進行氨基酸推導(dǎo)及進化關(guān)系分析。

1.2.3P113蛋白理化性質(zhì)分析采用在線軟件ExPASy(http://web.expasy.org/Compute PI/MW)和Protparam(http://web.expasy.org/protparam)分析預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。

1.2.4疏水性與親水性的預(yù)測與分析采用在線軟件Protscale(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/)分析蛋白疏水性與親水性。

1.2.5P113蛋白信號肽與跨膜區(qū)預(yù)測采用在線軟件SignalP 4.0(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP)和TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.6P113蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測 采用在線軟件NetNGlyc1.0、NetPhos2.0和NetPhosk1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/)預(yù)測蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點。

1.2.7P113蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用在線軟件PHD sec(https://www.predictprotein.org/)和(Immune Epitope Database，IEDB)(http://www.iedb.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、溶劑可及性和三級結(jié)構(gòu)。

1.2.8 P113蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗采用在線軟件PDBsum Generate(http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/Generate.html)檢驗蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

1.2.9P113蛋白B細胞抗原表位預(yù)測采用在線軟件IEBD(http://www.iedb.org/)提供的蛋白氨基酸序列抗原表位在線預(yù)測工具進行B細胞抗原表位預(yù)測和分析。

2結(jié)果與分析

2.1Mo P113基因克隆與序列分析

對Mo貴州流行株 P113基因進行分段擴增發(fā)現(xiàn)，4對引物分別擴增出約875、1 081、919和1 053 bp的特異性片段(圖1)，與預(yù)期目的條帶大小相符。應(yīng)用pMD19-T載體對Mo貴州流行株 P113基因分段序列進行克隆并測序，測序序列經(jīng)DNAStar 軟件Seqman工具拼接后獲得3 240 bp的 P113基因序列，推導(dǎo)氨基酸序列見圖2。由圖2可知，Mo GZ-QX1株 P113基因編碼1 079個氨基酸，在推導(dǎo)氨基酸序列551位、621位、665位密碼子為TGA，可作為終止密碼子，但對 P113全基因推測不作為終止密碼子，而是編碼色氨酸(Trp)。其與Y98標(biāo)準(zhǔn)株、四川SC01株、豬肺炎支原體P97、絲狀支原體山羊亞種(Mmc)和山羊支原體山羊亞種(Mccp)的相似性分別為99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%，由進化分析結(jié)果可知，Mo GZ-QX1株與Y98標(biāo)準(zhǔn)株親緣關(guān)系最近，與SC01株同處一個進化分支，與Mhp P97蛋白進化關(guān)系較其他種類支原體更近；而Mmc和Mcc分為一支，與Mo親緣性較遠(圖3)。

M.200 bp Marker；1～4.4段擴增產(chǎn)物Amplified products of four segments；-.陰性對照Negative control

圖1PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

Fig.1Agarose gel electrophoresis pattern of PCR products

圖2　Mo貴州株(GZ-QX1) P113基因推導(dǎo)的氨基酸序列

圖3　各菌株基因系統(tǒng)進化樹

2.2P113蛋白理化性質(zhì)的分析

使用ExPASy(Compute PI/MW)、ProtParam 在線分析軟件預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及氨基酸組成。P113蛋白分子質(zhì)量為119.425 3 ku，分子結(jié)構(gòu)式為C5273H8364N1430O1715S6，理論等電點(pI)為8.63。其氨基酸組成中Ser(S)和Lys(K)最多，均占到11.6%以上，不含Cys(C)。在該蛋白的氨基酸中，堿性氨基酸有3種(Arg、His、Lys)，共156個，占14.5%；酸性氨基酸有2種(Asp、Glu)，共144個，占13.3%；親水性氨基酸有5種(Asn、Gly、Gln、Ser、Thr)，共399個，占37.0%；疏水性氨基酸9種(Ala、Ile、Met、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val、Leu)，共383個，占35.5%，推測P113蛋白為堿性蛋白。該蛋白在水溶液中280 nm的摩爾消光系數(shù)為51 800 mol/(L·cm)，蛋白質(zhì)量濃度為1 g/L時的吸光系數(shù)(Abs)為0.434；該蛋白在哺乳動物網(wǎng)狀細胞、酵母和埃希氏大腸桿菌中表達的半衰期分別大于 30、20和10 h，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為28.18，低于閾值40，在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。

2.3疏水性與親水性的預(yù)測與分析

利用Protscale在線預(yù)測Mo GZ-QX1株P(guān)113氨基酸序列的親疏水性(圖4)。圖中縱坐標(biāo)大于0的為疏水區(qū)，得分越高疏水性越強；反之，小于0的為親水區(qū)。 P113基因編碼的蛋白多肽鏈第491位具有最低得分，為-2.7(最強的親水性)，在第23位具有最高得分，為2.378(最強的疏水性)。由圖4可知，除局部為疏水區(qū)域外，大部分均為親水區(qū)域，因而整個多肽鏈表現(xiàn)為親水性。此結(jié)果與ProtParam預(yù)測結(jié)果一致，同時較好的親水性也使其可溶性隨之增加。

2.4P113蛋白信號肽與跨膜區(qū)預(yù)測

利用在線軟件SignalP 4.0和TMHMM 2.0分析此蛋白信號肽以及預(yù)測蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)。由圖5可知，Mo GZ-QX1株 P113基因所編碼氨基酸均不具有分泌信號肽的特征，因此進行蛋白原核表達前不需要對該蛋白基因進行修飾；由圖6可知，該蛋白僅有1個較為明顯的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，其序列為17～33，處于基因序列開始，可通過部分基因表達消除其對P113蛋白體外表達效果的影響。

圖4　 Protscale程序分析Mo GZ-QX1株P(guān)113的疏水性

圖5　Mo GZ-QX1株P(guān)113信號肽分析

2.5P113蛋白修飾結(jié)構(gòu)的預(yù)測

利用在線軟件NetNGlyc1.0、NetOGlyc3.1、NetPhos2.0和NetPhosk1.0分析預(yù)測Mo P113蛋白潛在N糖基化位點、潛在磷酸化位點以及保守的特異性蛋白激酶作用位點。由圖7-A可知，P113蛋白第2、59、173、207、294、329、336、341和406個氨基酸處共存在9個N糖基化位點；由圖7-B可知，P113蛋白有59個絲氨酸、16個蘇氨酸可能被磷酸化。上述磷酸化位點所對應(yīng)的磷酸激酶預(yù)測結(jié)果顯示，在P113蛋白上可能有PKC、PKA、cdc2、CKⅡ、DNAPK、PKG、ATM、p38MAPK、CKⅠ、INSR、SRC、RSK、EGFR和cdk5共14種保守的特異性蛋白質(zhì)激酶的結(jié)合位點(表2)，其中，在604處PKC得分最高，為0.84。因此推測，P113蛋白功能的發(fā)揮可能與激酶磷酸化有關(guān)，說明P113蛋白在翻譯后發(fā)生相關(guān)修飾，從而對其生物學(xué)功能進行調(diào)控。

圖7　Mo GZ-QX1株P(guān)113蛋白修飾結(jié)構(gòu)預(yù)測

項目ItemPKCPKAcdc2CKⅡDNAPKPKGATMp38MAPKCKⅠINSRSRCRSKEGFRcdk541085212322497109109253372275253906962338698718957209063053723253943384252752293494407976094403941551050508568574325305581453711326位點5976046185608956851017Position6336897026098997131019898902906694900715104010191023105510427711043105610661050103810441069

2.6P113蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用在線軟件PHD sec和SWISSMODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、溶劑可及性和三級結(jié)構(gòu)(圖8和圖9)。結(jié)果顯示，Sec預(yù)測組成P113蛋白多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的3種類型分別是α-螺旋(H)(圖9-A)、β-折疊(S)(圖9-B)和無規(guī)則卷曲(L)，比例分別是15.57%、14.18%和70.25%，以無規(guī)則卷曲為主，β-折疊較少；而其溶劑可及性[10-11]分別是暴露70.99%、埋藏23.54%以及中間5.47%，因此，P113氨基酸殘基主要是暴露的，也證明其具有親水性。分析P113蛋白的三級結(jié)構(gòu)可知，其主要以無規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角散在存在，充分與周圍的極性環(huán)境相接觸，為抗原表位的形成提供有利條件(圖9)。

2.7P113蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗

利用PDBsum Generate在線軟件進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗(圖10)。根據(jù)構(gòu)象的穩(wěn)定性，Ramachandran圖預(yù)測結(jié)果顯示紅色、棕色2個區(qū)的比例分別為93.9%和6.1%，其余的都為0%(圖10-A)。蛋白結(jié)構(gòu)G-factor得分總平均值為0.33(圖10-B)，說明該結(jié)構(gòu)在正常范圍內(nèi)。其二級結(jié)構(gòu)和拓撲結(jié)構(gòu)信息 ( 圖10-C)、以及蛋白質(zhì)結(jié)合位點三維圖和預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)表明，其表面可能存在催化口袋及結(jié)合位點( 圖 10-D)，體積最大前4位分別為980.44、946.27、946.89和635.34，對應(yīng)的R比值依次是 1.04、0.00、0.00和0.00，可接近頂點依次為 60.22、63.35、60.52和67.37，深埋頂點依次為8.55、8.95、7.45和11.26。

圖8　 Mo GZ-QX1株P(guān)113二級結(jié)構(gòu)與溶劑可及性預(yù)測結(jié)果

A.α-螺旋　α-Helix；B.β-折疊　β-Strand

2.8P113蛋白B細胞抗原表位預(yù)測

采用Emini、Kolaskar-Tongaonkar、Parker、Karplus-Schulz以及Bepipred方法分別對P113蛋白的表面可及性、抗原指數(shù)、親水性、柔韌性和線性表位進行預(yù)測(圖11)。表面可及性程度(默認閾值為1.0)預(yù)測結(jié)果表明，P113蛋白共有19個表面可及性程度高的肽段，其中有7個肽段的表面可及性程度最高(圖11-A)；抗原性(默認閾值為1.0)預(yù)測結(jié)果顯示，共獲得20個具有抗原性的肽段，且抗原性的強弱不同，其中有5個肽段的抗原性最強(圖11-B)；柔韌性(默認閾值為1.0)和親水性(默認閾值為1.0)等預(yù)測結(jié)果顯示，高于閾值的肽段部分可能參與P113蛋白線性B細胞表位的功能體現(xiàn)(圖11-C和圖11-D)；預(yù)測的線性B細胞表位(默認閾值為0.35)結(jié)果顯示，共獲得21條線性B細胞表位，其中2、5、10號和19號肽段的氨基酸均小于7個，不符合B細胞表位的要求。綜合上述預(yù)測結(jié)果，最終確定P113蛋白的B細胞表位(圖11-E)。說明，Mo GZ-QX1株P(guān)113蛋白含有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu)，預(yù)測其具有較好的抗原性，體外表達產(chǎn)物可應(yīng)用于診斷、檢測方法建立，也可作為免疫防控靶標(biāo)蛋白使用。

A. Procheck預(yù)測蛋白Ramachandran圖及檢驗數(shù)據(jù)The protein Ramachandran diagram and structural test data of Ramachandran prediction；B. Procheck結(jié)構(gòu)檢驗G-factor數(shù)據(jù)The protein structural test G-factor data of Ramachandran prediction；C. PDBsum Generate預(yù)測模型蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)信息PDBsum Generate information on protein structure prediction models；D. PDBsum Generate預(yù)測蛋白表面可能存在的催化口袋及結(jié)合位點Prediction of the protein surface binding sites and the catalytic pocket with PDBsum Generate

圖10Mo GZ-QX1株P(guān)113蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗

Fig.10Verification of Mo GZ-QX1 P113 protein structure

A. Emini表面可及性預(yù)測圖Emini surface accessibility prediction; B. Kolaskar-Tongaonkar抗原指數(shù)預(yù)測圖Kolaskar & Tongaonkar antigenicity prediction; C. Parker親水性預(yù)測圖Parker hydrophilicity prediction; D. Karplus-Schulz柔韌性預(yù)測圖Karplus & Schulz flexibility prediction;E. B細胞線性表位肽預(yù)測 Bepipred linear epitope prediction

圖11P113蛋白B細胞抗原表位預(yù)測結(jié)果

Fig.11Bepipred cell antigen epitope prediction results of P113 protein

3討 論

生物信息學(xué)(Bioinformatics)是在生命科學(xué)研究中以計算機為工具，對生物信息進行儲存、檢索和分析的科學(xué)，其目的在于認識生命的起源、進化、遺傳和發(fā)育的本質(zhì)，破譯隱藏在DNA序列中的遺傳信息，為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供最合理的和有效的方法或途徑[12]。P113蛋白序列生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，P113蛋白是分子質(zhì)量約為119 ku的強親水性堿性蛋白；該蛋白在哺乳動物、酵母細胞和埃希氏大腸桿菌中有較長的半衰期，且蛋白質(zhì)特性穩(wěn)定，因此可在原核和真核細胞中進行重組表達[13-14]。螺旋和折疊化學(xué)鍵能的高低是能否牢固維持蛋白高級結(jié)構(gòu)的條件之一，化學(xué)鍵能越高越牢固，因此，二級結(jié)構(gòu)是蛋白功能分析的重要指標(biāo)之一[15]。P113蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，該蛋白包含螺旋、折疊和無規(guī)卷曲，且以無規(guī)卷曲為主。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)檢驗是采用ExPASy提供的同源建模、線串法和從頭算法3種生物信息學(xué)方法及工具對P113蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進行初步模擬[16]，預(yù)測結(jié)果顯示，P113蛋白表面可能存在催化口袋及結(jié)合位點，其對DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用在基因調(diào)節(jié)方面起著重要作用。

蛋白表達是指用模式生物，如細菌、酵母、動物細胞或者植物細胞表達外源基因蛋白的一種分子生物學(xué)技術(shù)，在基因工程技術(shù)中占有核心地位[17]。本研究根據(jù)GenBank公布的四川SC01株綿羊肺炎支原體 P113基因序列，設(shè)計特異性引物，從GZ-QX1貴州株和Y98標(biāo)準(zhǔn)株中克隆該基因，經(jīng)酶切試驗及DNA測序驗證克隆成功。分析GZ-QX1貴州株 P113基因編碼的氨基酸序列可知，該基因全長3 240 bp，編碼1 079個氨基酸，且在3個氨基酸處表現(xiàn)與其他支原體相同的編碼特性，TGA編碼色氨酸且不作為終止密碼子；然而目前的生物技術(shù)尚不能直接對該基因進行原核表達，需通過PCR方法進行該基因的定點突變，使TGA突變?yōu)門GG后再進行表達，或選擇避開這幾個位點且抗原性較好的肽段進行表達[18-19]。在對Mo GZ-QX1株 P113基因推導(dǎo)的氨基酸序列進行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，P113蛋白是一種具有1個跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白，在進行表達時應(yīng)避開其所處位置，減少其對表達效果的影響。

磷酸化、去磷酸化是信號傳導(dǎo)通路中最簡便快捷的方式，其磷酸基團的增加或減少對很多生物反應(yīng)起著決定性作用，通常表現(xiàn)為磷酸化激活和去磷酸化失活[20]。NetPhos2.0 預(yù)測發(fā)現(xiàn)，P113蛋白有59個絲氨酸、16個蘇氨酸以及8個酪氨酸可能作為蛋白激酶磷酸化潛在作用位點而參與細胞的信號傳導(dǎo)；其可能有14種保守的特異性蛋白質(zhì)激酶的結(jié)合位點，其中在604位點處PKC得分最高，為0.84，說明P113蛋白可能是某信號傳導(dǎo)通路中的信號分子，但仍需進一步試驗研究和驗證。

抗原表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團，而B細胞表位是可被B細胞表面受體或抗體特異性識別并相互結(jié)合的片段[21]。有研究顯示，可通過氨基酸性質(zhì)(表面可及性、親水性、柔韌性以及抗原指數(shù))和隱形馬爾可夫模型預(yù)測線性表位[22]?？乖娜犴g性高說明其易于結(jié)合B細胞受體；表面可及性的大小代表抗原中的B細胞表位與B細胞受體識別并接近的難易程度且呈正相關(guān)；抗原親水性分子的大小決定抗原B細胞表位的多少[23]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測方法對結(jié)構(gòu)蛋白的潛在B細胞抗原表位進行預(yù)測和分析，根據(jù)不同參數(shù)綜合評價結(jié)構(gòu)蛋白可能存在的抗原優(yōu)勢表位，預(yù)測結(jié)果顯示，P113蛋白中共有19個表面可及性程度高的肽段，同時獲得20個具有抗原性的肽段和21條線性B細胞表位，表明Mo GZ-QX1株P(guān)113蛋白含有較多的優(yōu)勢抗原表位結(jié)構(gòu)，可作為一種免疫原性蛋白初步應(yīng)用于免疫學(xué)相關(guān)研究。通過DNAStar軟件對Mo GZ-QX1 P113蛋白序列與Y98標(biāo)準(zhǔn)株、四川SC01株及豬肺炎支原體P97、絲狀支原體山羊亞種(Mmc)和山羊支原體山羊亞種(Mccp)的相似性進行比對，發(fā)現(xiàn)其相似性分別達到99.9%、81.9%、60.4%、3.9%和5.2%；同時通過對推導(dǎo)的氨基酸序列構(gòu)建進化樹，發(fā)現(xiàn)Mo P113蛋白與Mhp p97蛋白存在交叉抗原，與絲狀支原體山羊亞種和山羊支原體山羊亞種的交叉抗原相關(guān)系數(shù)較低，也證實目前市場商業(yè)化羊傳染性胸膜肺炎的疫苗不能防控Mo的感染與流行，需盡快制備有效防控Mo的疫苗[24-25]。本研究的分析結(jié)果將為Mo P113基因工程疫苗和體外表達的應(yīng)用研究提供依據(jù)。

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Received 2015-09-09Returned2015-10-22

Foundation itemThe Scientific and Technological Cooperation Projects with Development of Grass to Keep Sheep Industry in Qianxinan State(No. The Scientific and Technological Cooperation in Qianxinan[2012]5); Science Foundation of Guizhou Province (No. The Scientific and Technological Cooperation Section J of Guizhou [2015]2082); Agricultural Research Project in Guizhou Province (No. The Scientific and Technological Cooperation of Guizhou NY[2014]3042); Science and Technology Innovation Team Project in Guizhou Province (No. The Scientific and Technological Cooperation Team of Guizhou [2015]4016); Graduate Student Innovation Fund Project in Guizhou University (No. School Fund Agriculture,2015029).

First author WU Yan,female,master student. Research area:animal disease etiology. E-mail: 491537385@qq.com

(責(zé)任編輯：郭柏壽Responsible editor:GUO Baishou)

Clone and Bioinformatics Analysis of P113 Gene ofMycoplasmaovipneumoniaein Guizhou Province

WU Yan1,2,YUAN Haiwen1,2,WANG Qi1,2,YUE Jun3,WEN Ming1,2,ZHOU Bijun1,2and CHENG Zhentao1,2

(1. College of Animal Science,Guizhou University,Guiyang550025,China; 2.Key Laboratory of Animal Disease and Veterinary Public Health of Guizhou Province,Guiyang550025,China; 3. Animal Disease Prevention and Control Center in Guizhou Province,Guiyang550008,China)

AbstractThe assay was aimed to access the biological characteristics of P113 protein in Mycoplasma ovipneumoniae(Mo) Guizhou strain (GZ-QX1). The protein structure,characteristics and function of GZ-QX P113 protein were predicted and analyzed by DNASTAR,MEGA 5.0 softwares,Protparam,Protscale and IEBD online tools in this study. The results showed that Mo GZ-QX1 P113 gene predicted is 3 240 bp,encoding 1 079 amino acid(AA),and sharing nucleotides sequence identity 99.9% with Mo Y98 standard strains 81.9% with SC01 Sichuan strain,60.4% with Mycoplasma hyopneumoniae P97,3.9% with Mycoplasma mycoides and 5.2% with Mycoplasma capripneumoniae. The molecular weight of P113 protein is 119 ku,with more advantages antigen epitope protein structure. Protein structure analysis showed that the protein had no transmembrane domain. There were 9 N-glycosylation sites,59 serine,16 threonine may be phosphorylated predicted and 14 conserved and specific phosphkinase binding sites. Protein functional analysis showed that P113 may function as a mediator in signaling pathway,but also a kind of good antigenic structure of proteins.

Key wordsMycoplasma ovipneumoniae; P113 gene; Bioinformatics analysis

Corresponding authorCHENG Zhentao,male,associate professor,master supervisor.Research area:animal studies on molecular etiology.E-mail: chengzhentao@sohu.com

中圖分類號S852.62

文獻標(biāo)志碼A

文章編號1004-1389(2016)03-0317-11

通信作者：程振濤，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事動物分子病原學(xué)研究。E-mail：chengzhentao@sohu.com

基金項目：黔西南州種草養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展省州科技合作專項(黔西南科合[2012]5號)；貴州省自然科學(xué)技術(shù)基金(黔科合J字 [2015]2082號)；貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)(黔科合NY[2014]3042)；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目(黔科合人才團隊[2015]4016號)；貴州大學(xué)研究生創(chuàng)新基金(?；鹧修r(nóng)2015029號)。

收稿日期：2015-09-09修回日期：2015-10-22

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160306.1610.002.html

第一作者：吳燕，女，碩士，研究方向為動物疫病病原學(xué)。E-mail：491537385@qq.com