葛蓓蕾　陳艷　左菲菲　姚珂　徐少博　徐霞

(1.鄭州大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心　河南 鄭州　450052； 2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院　河南 鄭州　450001)

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LSD1與冬凌草提取物相互作用的電化學(xué)研究

葛蓓蕾1陳艷2左菲菲2姚珂2徐少博2徐霞2

(1.鄭州大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心河南 鄭州450052； 2.鄭州大學(xué) 藥學(xué)院河南 鄭州450001)

【摘要】目的研究LSD1與冬凌草提取物的相互作用。方法在PH 7.40的緩沖液中，采用循環(huán)伏安法研究LSD1與冬凌草提取物(JD160和JD284)在不同條件下的相互作用。結(jié)果 在分別改變提取物濃度和掃描速率的條件下，提取物峰電流與提取物濃度和掃描速率均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。在pH 7.40的緩沖液中，LSD1無(wú)峰電流出現(xiàn)，提取物有峰電流出現(xiàn)，且其電化學(xué)行為具有典型的不可逆特征。當(dāng)LSD1逐漸加入到提取物中，二者發(fā)生作用，峰電流減小，峰電位負(fù)移。結(jié)論JD160和JD284均可與LSD1結(jié)合生成非電活性化合物，使電解液中游離化合物濃度降低。LSD1的加入使冬凌草提取物的氧化峰峰值電流減小。LSD1與JD160的相互作用可逆，與JD284不可逆。

【關(guān)鍵詞】LSD1；冬凌草提取物；循環(huán)伏安法；峰值電流

組蛋白的表觀遺傳共價(jià)修飾主要包括甲基化、乙?；?、磷酸化等。其中，組蛋白的甲基化是研究較多的修飾方式。賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶(lysine specific demethylase 1，LSD1) 是2004年被發(fā)現(xiàn)的第1個(gè)可以催化組蛋白h1K4和h1K9去甲基化的特異性去甲基化酶[1]。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，LSD1的活化過(guò)程與腫瘤細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，在前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)了LSD1的高表達(dá)[2-4]。因此，LSD1一直被視為一個(gè)重要的和有前途的抗癌目標(biāo)，新型LSD1抑制劑的研發(fā)也成了科研的熱點(diǎn)。

冬凌草是一種多年生草本植物，主產(chǎn)地在河南省濟(jì)源王屋山和太行山一帶。當(dāng)?shù)厝擞糜谥委熓车腊┮延?0多年的歷史[5]。冬凌草提取物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于治療腸炎、關(guān)節(jié)炎、黃疸、蛔蟲病、肝炎等病，先前的研究發(fā)現(xiàn)冬凌草中的二萜類化合物(如冬凌草甲素，冬凌草乙素)對(duì)人癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[6]。本研究選擇新的冬凌草提取物JD160(圖1A)和JD284(圖1B)，通過(guò)循環(huán)伏安法研究冬凌草提取物JD160和JD284與LSD1的相互作用。LSD1可以影響基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，JD160和JD284與LSD1之間的相互作用可能會(huì)為L(zhǎng)SD1抑制劑的研發(fā)提供一些重要的信息。

圖1　JD160(A)和JD284(B)的分子結(jié)構(gòu)

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器CHI-650A型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)，電化學(xué)實(shí)驗(yàn)用三電極系統(tǒng)：碳電極為工作電極，飽和甘汞電極和鉑電極分別作為參比電極和輔助電極。PHS-3C型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)，LSD1(美國(guó)Sigma公司)用二次重蒸水配制成0.125×10-6mol/L儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存。冬凌草提取物JD160和JD284(均為鄭州大學(xué)藥學(xué)院自制)溶于二甲基亞砜(DMSO，天津恒興化學(xué)試劑有限公司)配成濃度為0.5×10-3mol/L的儲(chǔ)備液，4 ℃冰箱保存。磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 4.0～6.86)備用，根據(jù)實(shí)際需要再稀釋到所需的pH值，在pH計(jì)上校準(zhǔn)。其它試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。實(shí)驗(yàn)用水為二次石英重蒸水。

1.2試驗(yàn)方法將碳電極在濕潤(rùn)的金相砂紙上磨光，然后用0.05 μm的Al2O3懸浮液拋光成鏡面，并依次用無(wú)水乙醇、二次重蒸水超聲波清洗，之后浸入到pH 7.4磷酸鹽電解液中備用。實(shí)驗(yàn)在室溫(25℃)下進(jìn)行。

在2個(gè)10 ml容量瓶中以pH 7.40的PBS緩沖液為底液，分別加入一定量的JD160和JD284溶液，在改變提取物濃度和掃描速率的條件下分別測(cè)定相應(yīng)的循環(huán)伏安曲線。在3個(gè)10 ml容量瓶中以pH 7.40的PBS緩沖液為底液，分別加入一定量的JD160和JD284溶液及LSD1溶液，然后在前兩者中加入一定量的LSD1溶液，測(cè)定相應(yīng)的循環(huán)伏安曲線。掃描速率100 mV/s，掃描范圍1.0～2.0 V。

2結(jié)果

2.1提取物濃度對(duì)峰值電流的影響用循環(huán)伏安法測(cè)定提取物濃度與峰值電流的關(guān)系如圖2所示。JD160和JD284濃度在1～8 μmol/L范圍逐漸增加時(shí)，與峰電流之間呈現(xiàn)線性關(guān)系。JD160濃度與峰電流的關(guān)系式為y=0.077x+0.085，相關(guān)系數(shù)R2=0.998；JD284濃度與峰電流的關(guān)系式為y=0.025x+0.136，R2=0.999。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，選取4 μmol/L的提取物用于下一步分析。

圖2　JD160(左)和JD284(右)濃度與峰值電流的關(guān)系

2.2掃描速率對(duì)峰值電流的影響在pH 7.4的PBS電解液中，JD160和JD284在玻璃碳電極的CV圖顯示，峰值電流在第二周期減小，說(shuō)明峰電流有吸附行為[7]。當(dāng)掃描速率分別為20、50、100、150、200和250 mV/s，掃描范圍為1～2 V時(shí)，得到的速率與電流的關(guān)系如圖3所示。隨著掃描速率增加，JD160和JD284的氧化電流增大，并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。JD160的峰電流與掃速的關(guān)系式為y=31.06x+2.368，R2=0.999；JD284的峰電流與掃速的關(guān)系式為y=32.00x+0.789，R2=0.998。二者關(guān)系說(shuō)明在一定的掃描速率區(qū)間內(nèi)，提取物JD160和JD284在電極表面上的反應(yīng)受吸附控制[8]。

圖3　不同掃描速率對(duì)6.0 μmol/l的JD160(左)和JD284(右)峰值電流的影響

2.3提取物與LSD1的相互作用循環(huán)伏安法測(cè)定結(jié)果如圖4所示。0.125×10-6mol/L的LSD1溶液在pH 7.4的PBS緩沖液中1.0～2.0 V的掃描范圍內(nèi)無(wú)峰電流出現(xiàn)。JD160和JD1284在pH 7.4的PBS緩沖液中有峰電流出現(xiàn)，且其電化學(xué)行為具有典型的不可逆特征[9]。當(dāng)LSD1逐漸加入到JD160和JD1284中，二者相互作用，峰電流減小，峰電位負(fù)移，說(shuō)明JD160和JD1284與LSD1發(fā)生了較強(qiáng)的作用。

a：0.125×10-6mol/L LSD1；b：4 μmol/L JD160 (JD284)；c：4 μmol/L JD160 (JD284) +0.125×10-6mol/L LSD1；d：4 μmol/L JD160 (JD284) +0.25×10-6mol/L LSD1。

圖4提取物JD160(左)和JD284(右)與LSD1的相互作用

2.4相互作用時(shí)間對(duì)峰值電流的影響反應(yīng)時(shí)間與峰值電流變化的關(guān)系見(jiàn)圖5。由左圖可見(jiàn)，隨著JD160與LSD1相互作用時(shí)間的增加，氧化電流開(kāi)始下降，但二者作用到一定時(shí)間后，氧化電流逐漸增大。從電流減少轉(zhuǎn)向增大發(fā)生在相互作用30 min到40 min之間。由此初步推斷，LSD1與JD160可以結(jié)合生成非電活性化合物，且LSD1對(duì)JD160的抑制作用是可逆的。由右圖可見(jiàn)，隨著JD284與LSD1相互作用時(shí)間的增加，氧化電流開(kāi)始下降，但二者作用15 min后，氧化電流基本保持穩(wěn)定。由此推斷LSD1對(duì)JD284的抑制作用可能是不可逆的。

圖5　相互作用時(shí)間對(duì)JD160(左)和JD284(右)峰值電流的影響

2.5電化學(xué)參數(shù)的計(jì)算JD160和JD1284與LSD1相互作用前后的電子轉(zhuǎn)移系數(shù)可以按照下列公式計(jì)算：

|Ep-Ep/2|= 0.056 5/n

Ep/2是半峰電位，n是電子轉(zhuǎn)移常數(shù)。JD160和JD284的n值計(jì)算結(jié)果均為1。電子轉(zhuǎn)移系數(shù)α是用來(lái)描述電極電勢(shì)對(duì)陰陽(yáng)極反應(yīng)影響的程度，也是最動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一。根據(jù)Laviron理論[10]來(lái)估算α。

Ep=Eo-(RT/αnF)ln(αnF/RTK)-(RT/αnF)lnυ.

其中R是通用氣體常數(shù)[8.314 J/(K·mol)]，T是298K，F(xiàn)是法拉第常數(shù)(96487 C/mol)，υ是掃描速率。JD160的Epa和lnυ的線性關(guān)系為Epa= 0.073 6lnυ +1.27，R2= 0. 990，結(jié)合以上公式計(jì)算出α值為0.348。JD284的Epa和lnυ的線性關(guān)系為Epa= 0.064lnυ +1.23，R2= 0.990， 得出α值為0.40。

3討論

本文利用循環(huán)伏安法研究LSD1和冬凌草提取物之間的相互作用。結(jié)果表明，當(dāng)LSD1逐漸加入到JD160和JD1284中時(shí)，二者相互作用，峰電流減小，峰電位負(fù)移，但隨著作用時(shí)間的增加，氧化電流開(kāi)始下降，繼續(xù)作用到一定時(shí)間后，JD160氧化電流逐漸增大，JD1284氧化電流基本不變。這表明JD160和JD284可以與LSD1結(jié)合，生成非電化合物。LSD1對(duì)JD160的抑制是可逆的，對(duì)JD284的抑制不可逆。據(jù)此推測(cè)，LSD1與兩種提取物作用的結(jié)果不同可能與提取物的結(jié)構(gòu)和相互作用的機(jī)制有關(guān)。化學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果示，JD160和JD284的電子轉(zhuǎn)移常數(shù)n為1，JD160和JD284電子轉(zhuǎn)移系數(shù)α分別為0.348和0.40。

綜上所述，我們成功地采用循環(huán)伏安法對(duì)LSD1與提取物的作用進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該方法具有良好的靈敏度及選擇性，有良好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)也為新型LSD1抑制劑的研發(fā)提供了思路。

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Electrochemical detection of lysine specific demethylase 1(LSD1) and Rabdosia extracts

Ge Beilei1, Chen Yan2, Zuo Feifei2, Yao Ke2, Xu Shaobo2, Xu Xia2

(1.TheLaboratoryAnimalCenter,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China；2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

【Abstract】ObjectiveTo screen the interaction of lysine specific demethylase 1(LSD1) and Rabdosia extracts. MethodsIn pH 7.4 buffer, the interaction of LSD1 and Rabdosia extracts (JD160 and JD284) was detected by cyclic voltammetry under different conditions. ResultsWhen changing extract concentration and scan rate respectively, the peak current of extract showed good linear relationship with the extract concentration and scan rate. In pH 7.40 buffer, no peak current of LSD1 appeared, while the peak current of extract appeared, and the electrochemical behavior was typically irreversible. When adding LSD1 into the extract gradually, the peak current obviously decreased, and there was a negative shift in the oxidation peak of extracts. ConclusionBoth JD160 and JD284 can be combined with LSD1 to generate non-electric complexes, which led to a decrease in the free drug concentration in the solutions. From changes to the reduction and oxidation currents, it can be concluded that the inhibition of JD160 against LSD1 is reversible, whereas JD284 is irreversible.

【Key words】lysine specific demethylase 1; Rabdosia extracts; cyclic voltammetry; peak current

(收稿日期：2015-10-27)

【中圖分類號(hào)】R 915

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.04.004

基金項(xiàng)目：河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A350598)。