崔　凱，　李　瑞，　王　濤，　葉章群，　劉繼紅△，　饒　可△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院　1泌尿外科　2泌尿外科研究所，武漢　430030

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雄激素調(diào)控RhoA/Rho激酶改善去勢(shì)大鼠勃起功能障礙的機(jī)制研究*

崔凱1，2，李瑞1，2，王濤1，2，葉章群1，2，劉繼紅1，2△，饒可1，2△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1泌尿外科2泌尿外科研究所，武漢430030

摘要：目的探究雄激素調(diào)控RhoA/Rho激酶改善去勢(shì)大鼠勃起功能障礙的機(jī)制。方法40只健康8周齡SD雄性大鼠隨機(jī)分成4組：A組為對(duì)照組；B組為實(shí)驗(yàn)組，給予手術(shù)切除雙側(cè)睪丸；C、D組為干預(yù)組，大鼠手術(shù)去勢(shì)后每天給予不同濃度的十一酸睪酮(安特爾)灌胃(C組：20 mg/kg，D組：10 mg/kg)，其余組給予等量的生理鹽水。治療8周后，檢測(cè)大鼠血清睪酮濃度，海綿體測(cè)壓評(píng)價(jià)大鼠勃起功能，Western blot檢測(cè)大鼠陰莖海綿體S1P2/RhoA/Rho激酶的含量。結(jié)果相較于A組[(17.08±1.53)nmol/L]、C組[(15.47±1.62)nmol/L]和D組[(8.73±2.12)nmol/L]大鼠的血清睪酮濃度，B組[(1.34±0.62)nmol/L]明顯降低(均P<0.05)；海綿體測(cè)壓結(jié)果顯示B組MaxICP/MAP明顯小于A組、C組和D組(均P<0.05)；Western blot檢測(cè)S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2的蛋白在B組表達(dá)明顯高于A組、C組和D組(均P<0.05)。結(jié)論應(yīng)用安特爾進(jìn)行雄激素替代治療可以通過抑制S1P2/RhoA/Rho激酶的激活，從而抑制陰莖海綿體平滑肌收縮，改善去勢(shì)大鼠勃起功能。

關(guān)鍵詞：RhoA/Rho激酶；雄激素；去勢(shì)；勃起功能障礙

陰莖勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是指陰莖不能達(dá)到和(或)維持足夠的勃起硬度以獲得滿意的性生活[1]。來自馬薩諸塞州的一份報(bào)告顯示：全球年齡在40～70歲之間的男子中，ED的患病率高達(dá)52%[2]。如今，ED正在成為困擾全球男性的重要疾病之一。ED的發(fā)病因素有很多種，包括神經(jīng)因素、血管因素、內(nèi)分泌因素以及同樣重要的心理因素，其中由于老齡等因素引起的血清睪酮水平下降是導(dǎo)致ED的重要危險(xiǎn)因素之一[3]。近年來受到廣泛關(guān)注的遲發(fā)型性腺功能減退癥(late-onset hypogonadism，LOH)就是一種與年齡增長(zhǎng)相關(guān)的并且以血清睪酮低于正常水平為特征的臨床和生物化學(xué)綜合征，而由于血清睪酮水平降低而導(dǎo)致的ED則是LOH最主要的癥狀[4-5]。正常的血清睪酮水平是維持陰莖正常勃起的關(guān)鍵因素[6]。

陰莖勃起受到一氧化氮-環(huán)鳥苷酸(nitric oxide-cyclic guanosine monophosphate，NO-cGMP)，RhoA/Rho激酶，硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)等多種信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)。已有的研究認(rèn)為血清睪酮水平下降能夠通過NO-cGMP通路減少內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的活性和引起陰莖血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致ED[7],而對(duì)于睪酮和RhoA/Rho激酶途徑之間的聯(lián)系研究較少。最近研究發(fā)現(xiàn)，主要由血小板和紅細(xì)胞產(chǎn)生的一種1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)的鞘氨醇代謝產(chǎn)物可以通過作用于陰莖海綿體平滑肌上的S1P2受體，進(jìn)而激活RhoA/Rho激酶途徑，引起陰莖海綿體平滑肌收縮[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠手術(shù)去勢(shì)之后給予不同濃度十一酸睪酮胺丸(安特爾)灌胃[9]，然后通過評(píng)價(jià)大鼠的勃起功能和檢測(cè)陰莖組織蛋白表達(dá)的結(jié)果，研究補(bǔ)充睪酮改善去勢(shì)大鼠勃起功能和S1P2以及RhoA/Rho激酶之間的聯(lián)系。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

40只健康8周齡SD雄性大鼠(由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供)；十一酸睪酮膠丸(安特爾，默沙東公司提供)；睪酮測(cè)定試劑盒(直接化學(xué)發(fā)光法，Siemens Healthcare Diagnostics Inc，美國(guó))；RIPA裂解液(江蘇碧云天生物公司)；S1P2抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；RhoA抗體(英國(guó)Abcam公司)；ROCK1抗體(英國(guó)Abcam公司)；ROCK2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；羊抗兔和羊抗鼠二抗(武漢科瑞生物科技有限公司)；Powerlab四通道生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司)。

1.2模型的建立

40只健康8周齡SD雄性大鼠，體重250～310 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分成4組：A組為對(duì)照組；B組為實(shí)驗(yàn)組，給予手術(shù)切除雙側(cè)睪丸；C、D組為干預(yù)組，在大鼠手術(shù)去勢(shì)后每天給予不同濃度的安特爾灌胃(C組：20 mg/kg，D組：10 mg/kg)，其余組給予等量的生理鹽水。各組大鼠均飼養(yǎng)在溫度(24±1)℃，濕度60%～80%的環(huán)境中。

1.3測(cè)量各組大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓(intracavernous pressure，ICP)和血清睪酮水平

稱取適量戊巴比妥鈉，用生理鹽水稀釋成2%的溶液。腹腔注射麻醉大鼠，待麻醉完全后，將大鼠仰臥位固定四肢和頭部。對(duì)大鼠頸部消毒后取正中切口，分離頸部肌群，找到并游離右頸總動(dòng)脈。絲線結(jié)扎遠(yuǎn)心端，近心端使用動(dòng)脈夾夾閉，在中間取頸動(dòng)脈小切口，插入充滿肝素化生理鹽水的PE-50導(dǎo)管，導(dǎo)管另一端連接壓力換能器，監(jiān)測(cè)大鼠平均頸動(dòng)脈壓(mean artery pressure，MAP)。消毒大鼠腹部，取腹正中切口，找到大鼠前列腺背外側(cè)的陰莖海綿體神經(jīng)作為電刺激部位。剝離大鼠陰莖包皮，充分暴露大鼠陰莖海綿體，用充滿生理鹽水的25號(hào)穿刺針斜行刺入大鼠陰莖海綿體中，另一端連接壓力換能器，監(jiān)測(cè)大鼠ICP并記錄。連接到PowerLab工作臺(tái)，分別用2.5 V和5 V電壓刺激大鼠陰莖海綿體神經(jīng)(頻率15 Hz，波寬1.2 ms，刺激1 min，間隔3 min)，記錄ICP和MAP的變化。

大鼠頸動(dòng)脈測(cè)壓結(jié)束后，頸動(dòng)脈取血3 mL，用睪酮測(cè)定試劑盒測(cè)量大鼠血清睪酮水平。處死大鼠，取大鼠陰莖，清除尿道海綿體和陰莖背靜脈等組織，用生理鹽水沖洗干凈后放于-80℃保存。

1.4Western blot檢測(cè)大鼠陰莖海綿體中S1P2/RhoA/Rho激酶的含量

將大鼠陰莖海綿體用組織剪剪碎后，加入RIPA裂解液。使用超聲波破碎蛋白后，放入4℃預(yù)冷離心機(jī)離心取上清液。用BCA法檢測(cè)提取蛋白的濃度，取總蛋白量50 μg，放入沸水中10 min。配制10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠準(zhǔn)備電泳蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到0.45 nm的PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜置于5%的BSA溶液中封閉2 h，封閉完成后分別放入對(duì)應(yīng)的抗體中孵育過夜。取出后洗膜3次，每次10 min，然后按照說明書加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗，孵育1 h后再次洗膜3次，每次10 min，采用ECL化學(xué)發(fā)光并采集圖像進(jìn)行處理，使用Quantity One軟件分析圖像結(jié)果。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1各實(shí)驗(yàn)組大鼠生長(zhǎng)情況和血清睪酮水平

去勢(shì)后4組大鼠均飼養(yǎng)8周，其中各組大鼠生長(zhǎng)情況良好，無死亡情況出現(xiàn)，查各組大鼠血清睪酮水平B組[(1.34±0.62)nmol/L]較A組[(17.08±1.53)nmol/L]、C組[(15.47±1.62)nmol/L]和D組[(8.73±2.12)nmol/L]明顯降低(均P<0.05)。見圖1。

A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組，C組為補(bǔ)充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補(bǔ)充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖1　各組大鼠血清睪酮水平(n=10)Fig.1 The level of serum testosterone in rats in each group(n=10)

2.2大鼠海綿體測(cè)壓結(jié)果分析

分別用2.5 V和5 V電壓刺激大鼠海綿體神經(jīng)后，MaxICP/MAP結(jié)果2.5 V電壓刺激時(shí)B組(0.14±0.03)較A組(0.77±0.04)、C組(0.76±0.03)和D組(0.36±0.03)顯著降低(均P<0.05)；5 V電壓刺激時(shí)B組(0.19±0.03)較A組(0.83±0.04)、C組(0.82±0.04)和D組(0.47±0.04)顯著降低(均P<0.05)。圖2是各組大鼠在2.5 V和5 V刺激下海綿體測(cè)壓的ICP和MAP的監(jiān)測(cè)記錄和比較結(jié)果。

A：各組大鼠ICP和MAP監(jiān)測(cè)記錄；B：各組大鼠MaxICP/MAP結(jié)果(n=10)；A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組，C組為補(bǔ)充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補(bǔ)充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖2　各組大鼠在2.5 V和5 V電壓刺激下大鼠的ICP和MAP結(jié)果(n=10)Fig.2 Results of ICP and MAP in rats stimulated with voltage at 2.5 V and 5 V(n=10)

2.3Western blot檢測(cè)各組大鼠陰莖海綿體中S1P2/RhoA/ROCK通路的蛋白表達(dá)

結(jié)果顯示：B組S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2較A組、C組和D組明顯增高(均P<0.05)，見圖3。

A組為對(duì)照組，B組為實(shí)驗(yàn)組，C組為補(bǔ)充雄激素(20 mg/kg)組，D組為補(bǔ)充雄激素(10 mg/kg)組；與B組比較，*P<0.05圖3　Western blot檢測(cè)各組大鼠陰莖海綿體S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2蛋白表達(dá)水平(n=10)Fig.3 Western blot analysis of the expression of S1P2/RhoA/ROCK1/ROCK2 in the corpus cavernosum of rats(n=10)

3討論

陰莖海綿體內(nèi)皮細(xì)胞完整是陰莖正常勃起的保證[10]。完整的海綿體內(nèi)皮細(xì)胞不僅分泌血管舒張因子，而且分泌血管收縮因子，以調(diào)節(jié)陰莖的正常勃起及疲軟[10-12]。目前已有研究表明睪酮缺乏會(huì)直接或間接導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[7，13-14]。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的產(chǎn)生主要包括舒張血管因素減少和收縮血管因素增多：舒張血管的因素如eNOS及NO產(chǎn)生減少，而收縮血管的因素如內(nèi)皮素(endothelins，ETs)和RhoA/Rho激酶產(chǎn)生增多，導(dǎo)致正常陰莖海綿體舒張與收縮的平衡打破，最終導(dǎo)致ED[15-16]。

臨床研究表明，睪酮替代治療可以顯著改善血清睪酮水平較低的患者的勃起功能，但是其具體機(jī)制尚不清楚，目前關(guān)于睪酮替代治療改善勃起功能的機(jī)制研究多集中于eNOS途徑，而睪酮替代治療是如何影響陰莖海綿體內(nèi)的RhoA/Rho激酶途徑，從而發(fā)揮改善勃起功能的作用，相關(guān)研究較少。

RhoA/Rho激酶信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞形態(tài)維持、平滑肌收縮等多種生物學(xué)行為。RhoA是三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate，GTP)酶的家族成員之一，主要以非活化的狀態(tài)與二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)結(jié)合，當(dāng)GDP轉(zhuǎn)化成GTP后，RhoA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜，進(jìn)而激活其下游的信號(hào)分子：ROCK1和ROCK2。它們可以不依賴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度促進(jìn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的交聯(lián)導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌的收縮[17-18]。在陰莖非勃起狀態(tài)下，RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)的活性，催化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)磷酸化水平增高，使陰莖海綿體平滑肌處于收縮狀態(tài)；而在勃起時(shí)，RhoA/Rho激酶信號(hào)途徑被抑制，從而引起海綿體平滑肌舒張[19-20]。

S1P是一種具有重要生理功能的信使分子，主要由血小板和紅細(xì)胞產(chǎn)生。它擁有5個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，為S1P1～S1P5，現(xiàn)有研究表明S1P2在人陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞上有表達(dá)，當(dāng)S1P結(jié)合S1P2受體后可以激活RhoA/Rho激酶途徑，進(jìn)而使陰莖海綿體平滑肌收縮[8]。在用S1P誘導(dǎo)閹割大鼠的陰莖海綿體平滑肌肌條收縮的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著S1P劑量的增加及時(shí)間的延長(zhǎng)，肌條收縮力隨之增大，然而，當(dāng)用S1P誘導(dǎo)正常大鼠的陰莖海綿體平滑肌肌條收縮時(shí)，卻未見肌條明顯收縮[8]。以上的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可能是因?yàn)樾奂に厝狈?，海綿體平滑肌上的S1P2受體增加，對(duì)S1P的敏感性增加，導(dǎo)致海綿體平滑肌強(qiáng)烈收縮，因此我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中提出了假設(shè)：雄激素缺乏將激活S1P/S1P2信號(hào)通路，進(jìn)而激活RhoA/Rho激酶途徑，導(dǎo)致ED；當(dāng)給予雄激素替代治療后，以上異常激活途徑將會(huì)被糾正，進(jìn)而改善ED。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，B組的血清睪酮水平明顯低于其他組；相應(yīng)的海綿體測(cè)壓的結(jié)果顯示B組相較于其他組顯著降低，低劑量的D組大鼠的勃起功能有所改善，但是還未達(dá)到正常水平，而高劑量的C組大鼠的勃起功能基本恢復(fù)正常，說明應(yīng)用安特爾進(jìn)行雄激素替代治療確實(shí)可以改善去勢(shì)大鼠的勃起功能；Western blot的結(jié)果顯示相比于其他組，B組S1P2、RhoA、ROCK1和ROCK2水平顯著升高，可知睪酮缺乏可以使S1P2表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使RhoA/Rho激酶通路異常激活，引起陰莖海綿體平滑肌收縮，最終導(dǎo)致ED；而給予補(bǔ)充睪酮之后，這種異常激活途徑被糾正，S1P2表達(dá)下調(diào)，使RhoA/Rho激酶通路蛋白表達(dá)下降，從而改善ED。綜合來看，本實(shí)驗(yàn)結(jié)論有助于闡明安特爾發(fā)揮作用的具體方式，并且為研究雄激素替代治療改善LOH相關(guān)ED的機(jī)制提供新的思路。

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(2015-09-16收稿)

Androgen Improves Erectile Dysfunction by Regulating RhoA/Rho-kinase in Castrated Rats

Cui Kai1，2，Li Rui1，2，Wang Tao1，2etal

1DepartmentofUrology，2InstituteofUrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo investigate the mechanism of androgen regulating RhoA/Rho-kinase to improve erectile dysfunction in castrated rats.MethodsForty eight-week-old healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups：control group(group A)；experiment group(group B，in which rats were castrated)；intervention groups(groups C and D，in which rats were treated with different concentrations of testosterone undecanoate orally every day at 20 mg/kg and 10 mg/kg，respectively after being castrated).Animals in groups A and B were given 0.9% NS instead.After 8-week treatment，the level of serum testosterone，intracavernous pressure(ICP)and mean arterial pressure(MAP)were determined，and the expression of S1P2/RhoA/Rho-kinase detected in the penis by Western blot.ResultsThe level of serum testosterone was significantly lower in group B[(1.34±0.62)nmol/L]than in group A[(17.08±1.53)nmol/L]，group C[(15.47±1.62)nmol/L]and group D[(8.73±2.12)nmol/L](P<0.05 for all)；MaxICP/MAP was also lower in group B than in group A，group C and group D(P<0.05 for all)；the expression levels of S1P2/RhoA/Rho-kinase were higher in group B than in groups A，C and D(P<0.05 for all).ConclusionAndrogen replacement therapy can improve the erectile dysfunction by inhibiting the activation of S1P2/RhoA/Rho-kinase and thereby inhibiting the contraction of corpus cavernosum smooth muscle.

Key wordsRhoA/Rho-kinase；androgen；castration；erectile dysfunction

中圖分類號(hào)：R698.1

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.006

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81200435)；中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(No.14020180555)

崔凱，男，1990年生，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：kaicui1990@yeah.net

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jhliu@tjh.tjmu.edu.cn(劉繼紅)；raokeke2009@163.com(饒可)