曹小年，　胡發(fā)涌，　楊　熹，　來(lái)森艷，　孫　威，　胡俊波△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院　1胸外科　2腫瘤研究所　3胃腸外科，武漢　430030

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高表達(dá)p55PIK細(xì)胞株的建立及其對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞周期的影響*

曹小年1，胡發(fā)涌2，楊熹3，來(lái)森艷3，孫威1，胡俊波3△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1胸外科2腫瘤研究所3胃腸外科，武漢430030

摘要：目的構(gòu)建p55PIK高表達(dá)的質(zhì)粒，篩選穩(wěn)定高表達(dá)p55PIK的LoVo細(xì)胞系，檢測(cè)其對(duì)LoVo細(xì)胞周期的影響。方法以基因組cDNA為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目的片段，通過(guò)限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，T4 DNA連接酶將目的片段插入pcDNA3.1質(zhì)粒中；將攜帶p55PIK基因的pcDNA3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞，加入適量的G418篩選(500 μg/mL)，并通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和Western blot方法檢測(cè)p55PIK mRNA水平和蛋白水平，進(jìn)一步通過(guò)BrdU/PI摻入法檢測(cè)p55PIK對(duì)LoVo細(xì)胞周期和DNA合成的影響。結(jié)果成功構(gòu)建了p55PIK高表達(dá)的質(zhì)粒，并篩選出穩(wěn)定高表達(dá)p55PIK的LoVo細(xì)胞系；在LoVo細(xì)胞中高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)細(xì)胞S期的進(jìn)程和DNA的合成。結(jié)論成功構(gòu)建了pcDNA3.1-p55PIK質(zhì)粒，并篩選出p55PIK穩(wěn)定高表達(dá)的LoVo細(xì)胞系，高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)LoVo細(xì)胞S期的進(jìn)程和DNA的合成。

關(guān)鍵詞：p55PIK；穩(wěn)定細(xì)胞系；LoVo細(xì)胞；細(xì)胞周期；DNA合成

磷脂酰肌醇激酶-3-激酶(phosphatidylinositol kinase-3-kinase，PI3K)是生長(zhǎng)因子超家族的主要成員之一，其在調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、分化，腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移和血管生成中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。PI3K是由調(diào)節(jié)亞基和催化亞基構(gòu)成的異二聚體，其中ⅠA類PI3K的催化亞基包括p110α、p110β和p110δ，他們分別由PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD基因編碼；調(diào)節(jié)亞基包括p85α、p85β、p55α、p50α和p55γ，其中，p85α、p55α和p50α由PIK3R3基因編碼，p85β由PIK3R2基因編碼，p55γ由PIK3R3基因編碼[4]。正常生理狀態(tài)下，調(diào)節(jié)亞基與催化亞基結(jié)合,穩(wěn)定催化亞基表達(dá)并抑制催化亞基活性，當(dāng)細(xì)胞接受外界刺激時(shí)，調(diào)節(jié)亞基與細(xì)胞膜上的生長(zhǎng)因子受體結(jié)合并被磷酸化，進(jìn)而發(fā)生空間結(jié)構(gòu)的改變，暴露出催化亞基的活性基團(tuán)，活化的催化亞基能夠磷酸化PIP2成PIP3，后者能夠磷酸化Akt，從而激活下游信號(hào)通路[5]。

p55PIK是PI3K調(diào)節(jié)亞基之一，前期研究發(fā)現(xiàn)，p55PIK在多種腫瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，并發(fā)揮重要的作用[6-7]。2003年，Xia等[8]發(fā)現(xiàn)p55PIK與其他調(diào)節(jié)亞基的不同在于其N末端特異的24個(gè)氨基酸，針對(duì)其N末端特異的24個(gè)氨基酸，設(shè)計(jì)并合成了特異性的抑制p55PIK功能的多肽TAT-N24。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)TAT-N24干預(yù)p55PIK的功能能夠明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，提示p55PIK在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著重要的作用。為了進(jìn)一步研究p55PIK的具體作用，我們成功構(gòu)建了p55PIK高表達(dá)的質(zhì)粒，并篩選了其穩(wěn)定高表達(dá)的LoVo細(xì)胞系，以此為工具，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期和DNA合成的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及試劑

結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞及pcDNA3.1質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存，LoVo細(xì)胞培養(yǎng)于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液及胰酶購(gòu)自Hyclon公司；BrdU、GAPDH和p55PIK抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，BrdU購(gòu)自Sigma公司，各種二抗均購(gòu)自康維公司，各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)NEB公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司，PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000及Trizol購(gòu)自英駿公司。

1.2p55PIK質(zhì)粒的構(gòu)建及LoVo高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的建立

通過(guò)Trizol氯仿的方法提取細(xì)胞mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，應(yīng)用PCR技術(shù)將目的基因片段進(jìn)行擴(kuò)增(上游引物序列：5′-GGGG-TACCATGTACAATACGGTGTGGAG-3′，下游引物序列：5′-CGGAATTCTTATCTGCAAAGCG-AGGGCA-3′)，PCR條件：95℃預(yù)變性5 min，然后擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)，條件為95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳并做膠回收，將回收的產(chǎn)物和pcDNA3.1質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行雙酶切(KpnⅠ和EcoRⅠ)，然后將酶切產(chǎn)物以同樣的方法進(jìn)行膠回收，再通過(guò)T4 DNA連接酶進(jìn)行連接(16℃過(guò)夜)。將連接產(chǎn)物通過(guò)氯化鈣法轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，涂含有氨芐青霉素的瓊脂糖膠篩選單克隆，搖菌，小提質(zhì)粒后通過(guò)酶切鑒定，并將符合要求的菌液送北京華大公司測(cè)序。將測(cè)序正確的菌液進(jìn)行搖菌并大提質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒通過(guò)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞，24 h后加入500 μg/mL的G418進(jìn)行篩選，維持篩選2周后通過(guò)Western blot和real-time PCR進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3LoVo細(xì)胞周期及DNA合成的檢測(cè)(BrdU/PI檢測(cè)法)

將p55PIK高表達(dá)的LoVo細(xì)胞系和陰性對(duì)照的細(xì)胞正常培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合度時(shí)，加入BrdU(10 μg/mL)處理30 min，胰酶消化細(xì)胞后PBS洗2遍，并用75%的冰乙醇固定過(guò)夜。將固定好的細(xì)胞用PBS洗2遍，加入1 mL洗液(含5%的Tween 20的PBS)破膜后加入1 mL的鹽酸(2 mol/L)的洗液，室溫放置45 min后加入1 mL的0.1 mol/L的硼砂中和鹽酸，加入BrdU(人抗小鼠)一抗，室溫孵育1～2 h，加入FITC(山羊抗小鼠)熒光二抗，室溫避光孵育30 min，加入100 μL的PI，4℃避光放置15 min后上機(jī)檢測(cè)。

2結(jié)果

2.1pcDNA3.1-p55PIK質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將獲得的陽(yáng)性克隆進(jìn)行質(zhì)粒小提，經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，通過(guò)瓊脂糖電泳，在1 000～1 500 bp之間可見一明顯條帶，送北京華大公司測(cè)序結(jié)果與GenBank報(bào)道的序列完全一致，表明pcDNA3.1-p55PIK質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

M：10 000 bp核酸Marker；1：空質(zhì)粒酶切；2：pcDNA3.1-p55PIK質(zhì)粒酶切圖1　高表達(dá)p55PIK質(zhì)粒成功構(gòu)建Fig.1 Successful construction of p55PIK high-expression plasmid

2.2LoVo高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選及鑒定

LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-p55PIK質(zhì)粒及相應(yīng)的陰性對(duì)照后，加入500 μg/mL的G418篩選細(xì)胞，2周后收集細(xì)胞，通過(guò)real-time PCR和Western blot方法檢測(cè)p55PIK mRNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果表明：高表達(dá)p55PIK組的細(xì)胞與陰性對(duì)照相比，其p55PIK的mRNA水平和蛋白水平均有明顯的升高。見圖2。

A：各組p55PIK mRNA表達(dá)水平；B：各組p55PIK蛋白表達(dá)水平；與對(duì)照組比較，**P<0.01圖2　p55PIK高表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定Fig.2 Identification of stable cell lines with high expression of p55PIK

2.3p55PIK對(duì)LoVo細(xì)胞周期及DNA合成的影響

將p55PIK穩(wěn)定高表達(dá)的LoVo細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞正常培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右融合度時(shí)，通過(guò)BrdU/PI法檢測(cè)p55PIK對(duì)LoVo細(xì)胞周期和DNA合成的影響。結(jié)果顯示：陰性對(duì)照組處于DNA合成期的細(xì)胞占總體百分比為(28.62±1.87)%，高表達(dá)p55PIK組為(43.25±2.18)%；陰性對(duì)照組處于S期的細(xì)胞占總體百分比為(29.90±1.98)%，高表達(dá)組為(41.08±2.59)%，提示：高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)LoVo細(xì)胞DNA的合成，并能使細(xì)胞富集于S周期。見圖3。

2.4高表達(dá)p55PIK對(duì)p-Akt的影響

進(jìn)一步，我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)了高表達(dá)p55PIK對(duì)經(jīng)典的PI3K/Akt信號(hào)通路的影響。細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，收集細(xì)胞，并裂解細(xì)胞總蛋白，通過(guò)Western blot方法檢測(cè)了p-Akt、Akt、p55PIK、GAPDH的表達(dá)。結(jié)果顯示：在p55PIK高表達(dá)的細(xì)胞中，p55PIK的表達(dá)明顯升高；但是，相應(yīng)的p-Akt的表達(dá)卻沒有明顯的變化，見圖4。結(jié)果說(shuō)明p55PIK促進(jìn)細(xì)胞DNA的合成及細(xì)胞周期的進(jìn)程并不依賴于經(jīng)典的PI3K/Akt信號(hào)通路。

3討論

PI3K/Akt介導(dǎo)的信號(hào)通路在結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9]。p55PIK(由PIK3R3基因編碼)是PI3K調(diào)節(jié)亞基之一，我們前期研究發(fā)現(xiàn)p55PIK在結(jié)直腸癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，高表達(dá)p55PIK能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲遷移和血管生成，進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)，p55PIK發(fā)揮上述功能并非依賴經(jīng)典的PI3K/Akt信號(hào)通路[10-12]。為了進(jìn)一步探索p55PIK在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的功能和具體機(jī)制，我們構(gòu)建了p55PIK高表達(dá)的質(zhì)粒，并篩選了p55PIK穩(wěn)定高表達(dá)的結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明了p55PIK能夠穩(wěn)定高表達(dá)，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具。

A :BrdU/PI摻入法檢測(cè)各組細(xì)胞DNA的合成；B：細(xì)胞周期分布圖3　高表達(dá)p55PIK對(duì)LoVo細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of over-expression of p55PIK on DNA incorporation and cell cycle of LoVo cells

圖4　Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中p55PIK和p-Akt的表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of the expression of p55PIK and p-Akt in two groups

1995年，Pons等[13]首次報(bào)道了p55PIK為PI3K調(diào)節(jié)亞基之一。隨后，Xia 等[8]發(fā)現(xiàn)p55PIK與其他調(diào)節(jié)亞基的不同在于其N末端從線蟲到人類均高度保守的特異性的24個(gè)氨基酸，并進(jìn)一步證明了其N端24個(gè)氨基酸能夠與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)結(jié)合，促進(jìn)后者磷酸化，導(dǎo)致細(xì)胞周期的改變，針對(duì)p55PIK的特異性抑制劑N24能夠有效地阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。有研究表明，p55PIK與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)，其中在卵巢癌、肺癌、前列腺癌、肝癌和胃癌中呈明顯高表達(dá)狀態(tài)，與這些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6-7]。我們最新研究發(fā)現(xiàn)p55PIK能夠與細(xì)胞核增殖抗原(proliferation cell nuclear antigen，PCNA)直接結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。這些均提示p55PIK在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，針對(duì)p55PIK的特異性抑制劑有可能為腫瘤的治療提供新的、有效的靶點(diǎn)[10,14]。

我們?cè)诔晒?gòu)建的p55PIK穩(wěn)定高表達(dá)的LoVo細(xì)胞中，檢測(cè)了其對(duì)細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)p55PIK能夠明顯促進(jìn)LoVo細(xì)胞DNA的合成和細(xì)胞S期的富集，這提示p55PIK能夠促進(jìn)LoVo細(xì)胞的增殖，而且，我們還發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)p55PIK并不影響LoVo細(xì)胞p-Akt的水平，這提示其促進(jìn)細(xì)胞DNA合成和S期的進(jìn)程不是通過(guò)經(jīng)典的Akt信號(hào)通路，為我們的下一步機(jī)制研究提供了初步線索。

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(2015-08-27收稿)

Establishment of p55PIK High-expression Cell Line and Its Effects on Cell Cycle of LoVo Cells

Cao Xiaonian1，Hu Fayong2，Yang Xi3etal

1DepartmentofThoracicSurgery，2CancerResearchInstitute，3DepartmentofGastrointestinalSurgery，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

AbstractObjectiveTo construct the p55PIK high-expression plasmid，screen out LoVo cell line with stable high-expression of p55PIK，and examine the effect of p55PIK on cell cycle of LoVo cells.MethodsTarget fragment was amplified by polymerase chain reaction(PCR)，with the genomic cDNA as the template，and then cloned into the pcDNA3.1 vector by using restriction endonuclease and T4 DNA ligase.LoVo cells were transfected with pcDNA3.1-p55PIK vector and then G418(500 μg/mL)was added to identify stable overexpressed p55PIK cell line.Real-time quantative PCR and Western blot were used to detect the mRNA and expression levels of p55PIK.Furthermore，the effect of p55PIK on cell cycle progression and DNA synthesis was examined by BrdU/PI incorporation method.Resultsp55PIK high-expression vector was successfully constructed and LoVo cells with stable high-expression of p55PIK screened out.Over-expressed p55PIK in LoVo cells could promote cell cycle progression in S phase and DNA incorporation in LoVo cells.ConclusionStable LoVo cell line with p55PIK high expression was successfully obtained.Overexpressing p55PIK could promote cell cycle progress in S phase and DNA incorporation in the cells.

Key wordsp55PIK；stable cell line；LoVo cell line；cell cycle；DNA incorporation

中圖分類號(hào)：R735.35

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.02.002

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81301899，81372662)

曹小年，男，1984年生，博士研究生，E-mail：caoxiaonian@aliyun.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：jbhu@tjh.tjmu.edu.cn