劉彬

RGD-FasL 納米粒的體內(nèi)抗癌分析

劉彬

本文將RGD-FasL納米粒（RF-NPs），給肝癌模型小鼠進(jìn)行用藥，RF-NPs組對腫瘤抑制效果優(yōu)其他組，HE染色實(shí)驗(yàn)顯示，體內(nèi)肝臟組織中RF-NPs組血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤不明顯，僅有少量肝細(xì)胞輕度水腫和脂肪變性。TUNEL熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比RF-NPs和RF組腫瘤組織陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)增加，與RF組相比，RF-NPs組有更好的誘導(dǎo)凋亡的能力；RF-NPs作用于H22腫瘤后所引起的凋亡與Caspase-3，BAX 表達(dá)量增加，Bcl-2的表達(dá)量下降相關(guān)。

納米粒；抗癌

1 前言

除了傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療方式[1]，腫瘤免疫治療是一種新興抗癌治療方式，已開始被臨床所應(yīng)用[2]。載體藥物[3]是隨著藥劑學(xué)、生物材料科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的發(fā)展而新興的一種給藥形式。本文將兩者進(jìn)行結(jié)合，將有腫瘤血管靶向治療作用的RGD-FasL制成藥劑學(xué)中的納米粒，進(jìn)行小鼠體內(nèi)抗癌分析檢測。

2 實(shí)驗(yàn)材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

2.1.1 鼠源肝癌細(xì)胞H22由廈門大學(xué)抗癌研究中心保存。4-6周齡昆明雄性小白鼠(體重20±2g，共48只)由廈門大學(xué)抗癌研究中心動(dòng)物房提供。

2.1.2 主要試劑及耗材

RGD-FasL蛋白納米粒（實(shí)驗(yàn)室制備）；鼠抗β-actin單抗與兔抗Caspase-3單抗（Santa公司），兔抗Bcl-2單抗與兔抗Bax單抗（EPIT MICS公司）；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體與FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（Sigma公司）；Annexin V FITC試劑盒與SABC免疫組化試劑盒（BD公司）；TUNEL試劑盒（Roche公司）等。

2.1.3 主要儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)購（BIO-RAD 公司）；熒光顯微鏡（OLYMPUS）；AE31/CCIS LWD倒置顯微鏡（MOLTIC Co.,Ltd）；FATO超凈工作臺等。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 RGD-FasL蛋白納米粒的體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)[4]

取4-6周齡的昆明小鼠（平均體重20±2g）40只，右前腋部皮下注射H22細(xì)胞0.1mL。待所有小鼠長出腫瘤后,隨機(jī)將40只小鼠分成5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組8只：PBS組、RF組、RF-NPs 組、Blank NPs組、環(huán)磷酰胺(CTX)組。并取無腫瘤的正常小白鼠8只作為空白對照組(Blank)。每只小鼠注射0.2mL，環(huán)磷酰胺按50mg/kg藥量尾靜脈給藥。治療后根據(jù)公式計(jì)算出腫瘤生長抑制率，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。自第一天給藥開始每天觀察腫瘤生長及小鼠狀況，并每天測量小鼠體重。

腫瘤生長抑制率可按下列公式計(jì)算:

2.2.2 組織HE染色檢測

用藥結(jié)束，稱重、處死小鼠。根據(jù)腫瘤的部位、形狀、大小、顏色以及與周圍組織的關(guān)系，有無完整或不完整的包膜，取每只小鼠皮下腫瘤組織及肝組織，用一把鋒利的取材刀切取大小約1cm×1cm×0.2cm的組織。將組織固定、包埋、切片后，進(jìn)行HE染色實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

腫瘤組織切片常規(guī)脫蠟、水化、滴加蛋白酶與封閉液、加TUNEL染液、熒光封片液封片，最后放入切片盒，4℃避光保存；鏡下觀察，凋亡細(xì)胞呈黃綠色熒光顯色。

染色陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):陽性細(xì)胞染色分布有三種類型:①胞漿;②細(xì)胞核;③細(xì)胞膜表面。如果細(xì)胞之間染色強(qiáng)度相同，常提示其反應(yīng)為非特異性。陽性細(xì)胞染色定位于細(xì)胞，且與陰性細(xì)胞相互交雜分布;而非特異性染色常不限于單個(gè)細(xì)胞，而是累及一片細(xì)胞。切片邊緣、刀痕或皺折區(qū)域，壞死或擠壓的細(xì)胞區(qū)，膠原結(jié)締組織等，常表現(xiàn)為相同的陽性染色強(qiáng)度，不能用于判斷陽性。

2.2.4 Western-blot 檢測腫瘤凋亡效果

取腫瘤組織0.1g，預(yù)冷后研磨，在冰上裂解半小時(shí)，離心，用BRADFORD方法測量蛋白濃度，測完濃度后按照5：1的比例加入上樣緩沖液。分裝至PCR管變性處理，進(jìn)行SDS－PAGE 電泳（電泳時(shí)間100min，電壓100V，電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉與顯影。

2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件包作數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均用±s表示，計(jì)量資料采用單因素方差分析； P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 RGD-FasL 納米粒體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

如圖1，結(jié)果顯示：經(jīng)過 10 天的藥物處理后，與 PBS組的腫瘤重量3.96±0.55 g相比，RF 組、RF-NPs組腫瘤重量分別為2.58±0.36g和2.11±0.26 g，差異顯著（P＜0.05），與CTX組相比，RF-NPs組小鼠腫瘤重量減少明顯，無顯著性差異（P＞0.05），同時(shí)RF 組和RF-NPs組體重平均增加分別為11.28±3.39g、11.69 ± 2.31 g，均顯著高于 CTX組7±2.54g（P＜0.05），說明 RF-NPs對腫瘤生長的抑制作用與環(huán)磷酰胺作用相近并且RF-NPs的毒性更小。

圖1 各組小鼠體重和瘤重變化情況Fig.1 Comparison of body weight (A) and tumor weight (B) in H22 tumor bearing mice of each group

3.2 HE染色

在400倍放大顯微鏡下觀察各組肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖2，與PBS對照組相比，陽性藥物CTX組明顯可見大量的肝細(xì)胞核收縮和細(xì)胞壞死。RF-NPs組僅有少量肝細(xì)胞的胞核發(fā)生收縮，血管周圍淋巴細(xì)胞浸潤不明顯，肝細(xì)胞輕度水腫和脂肪變性，可見納米粒對肝組織的毒副作用較小。

圖2 H22腫瘤小鼠肝組織HE染色Fig.2 HE staining of organs of different treated H22-bearing mice. Arrow symbol are H22 tumor cells after treatment by PBS, RF, RF-NP, CTX.

3.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

熒光顯微鏡觀察 TUNEL 標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞及細(xì)胞核呈黃綠色，見圖3，PBS對照組和Blank NPs組有少量的TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，熒光強(qiáng)度較弱，而RF組、RF-NPs組TUNEL陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)組有所增加，陽性熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度較強(qiáng)。由此可以說明，RF-NPs比RF在EPR效應(yīng)基礎(chǔ)上具有更好的誘導(dǎo)腫瘤組織肝癌細(xì)胞凋亡的能力。

圖3 小鼠腫瘤組織TUNEL熒光染色照片F(xiàn)ig.3 TUNEL staining apoptosis of tumor bearing mice. Arrow symbol are H22 tumor positive cells after treatment by RF, RF-NP.

3.4 Western-blot 檢測腫瘤組織凋亡通路

圖4 Western blotting 分析RF-NPs對小鼠肝癌H22腫瘤模型中Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig4 Western blot analysis of Caspase3、Bax and Bcl-2 expressions in RFNPs treated mouse H22 tumor model

依照 Western-blot 操作流程，檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)量變化。與PBS對照組相比，RF-NPs和RF組的Caspase-3、Bax的表達(dá)水平上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下降，而Blank NPs組的蛋白表達(dá)變化不顯著。如圖4。

3.5 討論

RGD作為腫瘤血管靶向的載體，使藥物在腫瘤血管部位發(fā)揮更大的作用，F(xiàn)asL作為細(xì)胞凋亡的重要配體，在靶向位置發(fā)揮更好的殺死癌細(xì)胞的作用[5]。而納米粒因?yàn)镋PR效應(yīng)在腫瘤部位有更多的分布，最終實(shí)現(xiàn)雙靶向的作用，對腫瘤抑制起到更好的作用。

（作者單位：吉林工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院質(zhì)量安全系 制藥技術(shù)教研室）

[1]王軒，陸累，華長江等.原位肝移植治療原發(fā)性肝癌68例報(bào)告[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2009,2,14(2):147-149．

[2]張?jiān)?，楊吉?肝癌免疫治療的研究現(xiàn)狀.[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(8):1648-1650．

[3]陳汝福，陳積圣.納米技術(shù)在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用.[J].癌癥2004;23:1714-1716

[4]劉彬，楊晶，羅芳紅，莊國紅等. RGD-FasL羥乙基殼聚糖緩釋納米粒制備及生物學(xué)研究.[J].中國生化藥物雜志.2012,33(6)

[5]馬玲娟，嚴(yán)俊，張曉莉.單克隆抗體耦聯(lián)物治療腫瘤的研究與進(jìn)展.[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志20l0;31:1142-1144.

劉彬（1982～），男，碩士研究生，助教，研究方向?yàn)榘邢蚩拱┭芯?，教學(xué)方向?yàn)樗巹W(xué)、藥理學(xué)、藥物檢驗(yàn)的教學(xué)。