童　霞　許曉梅　葉　穎　韓建雄

成都市第五人民醫(yī)院消化內科(611130)

?

miR-504在原發(fā)性肝細胞癌中的表達及其臨床意義

童霞*許曉梅葉穎韓建雄

成都市第五人民醫(yī)院消化內科(611130)

背景：microRNA表達失調與腫瘤的形成相關。miR-504在多種腫瘤中表達，但在肝癌中的表達目前尚未見相關報道。目的：探討miR-504在原發(fā)性肝細胞癌(HCC)和肝癌細胞株中的表達及其與預后的關系。方法：收集85例HCC患者手術標本，常規(guī)培養(yǎng)5株肝癌細胞株和永生化肝細胞株。以CCK8法檢測miR-504表達對HepG2細胞增殖的影響，實時熒光定量PCR法檢測miR-504表達，分析miR-504表達與HCC患者臨床病理特征和預后的關系。結果：與正常肝細胞相比，5種肝癌細胞中miR-504表達顯著降低(P<0.05)。上調miR-504表達明顯抑制HepG2細胞增殖，而下調miR-504表達則促進細胞增殖。HCC患者miR-504表達顯著低于相應癌旁組織，且與腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.021)、甲胎蛋白(P=0.012)和門靜脈癌栓(P=0.003)密切相關，但與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量無關。miR-504低表達者的生存時間較高表達者明顯縮短(P<0.05)。結論：miR-504在HCC中表達下調，其表達與患者的臨床預后相關，提示miR-504可作為判斷HCC患者預后的獨立預測因子。

關鍵詞癌，肝細胞；miR-504；細胞增殖；預后

Expression and Clinical Significance of miR-504 in Primary Hepatocellular Carcinoma

TONGXia,XUXiaomei,YEYing,HANJianxiong.

DepartmentofGastroenterology,ChengduFifthPeople’sHospital,Chengdu(611130)

Background: Dysregulation of microRNA expression is involved in the carcinogenesis of many tumors, expression of miR-504 has been observed in many tumors, but its expression in primary hepatocellular carcinoma (HCC) has not been reported. Aims: To explore the expression and clinical significance of miR-504 in HCC tissues and cells. Methods: Tumor and para-cancerous tissue in 85 HCC patients were collected. Five liver cancer cell lines and immortalized liver cell line were conventionally cultured. Effect of miR-504 expression on HepG2 cells proliferation was determined by CCK8 assay. The expression of miR-504 was determined by real time fluorescent quantitative PCR. Relationships between expression of miR-504 and clinicopathological features and prognosis of HCC patients were analyzed. Results: Compared with normal liver cells, expression of miR-504 was significantly downregulated in five liver cancer cells (P<0.05). Up-regulation of miR-504 inhibited proliferation of HepG2 cells, and down-regulation of miR-504 promoted proliferation of HepG2 cells. miR-504 expression in tumor tissue was significantly decreased than that in corresponding para-cancerous tissue. Expression of miR-504 was correlated with tumor differentiation (P=0.002), TNM stage (P=0.021), alpha fetoprotein (P=0.012) and portal vein tumor thrombus (P=0.003), but not with gender, age, tumor size and tumor number. Survival in HCC patients with lower miR-504 expression was significantly shorter than that in patients with high expression (P<0.05). Conclusions: Expression of miR-504 is downregulated in HCC, and is correlated with the prognosis of patients, suggesting that miR-504 can be used as an independent predictor for prognosis of HCC patients.

Key wordsCarcinoma, Hepatocellular;miR-504;Cell Proliferation;Prognosis

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球死亡率居前列的惡性腫瘤，亦是我國常見的惡性腫瘤。HCC的發(fā)生、發(fā)展是包括原癌基因激活或(和)抑癌基因失活在內的多階段多步驟過程。越來越多的研究表明，除HCC內蛋白編碼基因的變異，miRNAs表達失調亦會促進HCC的發(fā)生[1-3]。miRNAs是一類長約19～25個核苷酸的小分子非編碼RNA，進化上具有保守性，能以不完全方式與mRNA分子的3’UTR區(qū)結合，在轉錄和轉錄后水平上抑制靶基因表達，在細胞生長、增殖、發(fā)育和凋亡過程中發(fā)揮重要作用，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關[4-5]。Kikkawa等[6]發(fā)現(xiàn)，miRNA-504(miR-504)通過靶向CDK6抑制下咽部鱗狀細胞癌的增殖；Hu等[7]發(fā)現(xiàn)miR-504表達與p53呈負相關，是腫瘤形成中的重要miRNAs；Zhao等[8]發(fā)現(xiàn)miR-504通過下調核呼吸因子1表達，導致鼻咽癌放射抵抗。然而，miR-504在HCC中的表達及其意義目前尚未見相關報道。本研究通過檢測HCC細胞和組織中miR-504表達，旨在分析其臨床意義，從而為miR-504用于HCC的診斷、治療提供理論依據(jù)。

材料與方法

一、資料來源

收集2009年1年—2011年1月成都市第五人民醫(yī)院肝膽外科行手術切除的85例HCC患者的腫瘤和癌旁組織標本，診斷均由術后病理學確診。所有患者均簽署知情同意書，臨床資料完整。術前均未行放化療、介入治療等抗腫瘤治療。所有患者均接受一般情況、臨床癥狀和影像學檢查的隨訪，隨訪方式為電話、門診和住院隨訪。隨訪起點為病理確診日期，末次隨訪時間為2015年7月31日，至末次隨訪時，存活病例47例，死亡38例，無失訪病例。本研究方案經我院倫理委員會批準。

二、細胞培養(yǎng)

永生化正常肝細胞株L02和5株肝癌細胞株(HepG2、MHCC97H、MHCC97L、PLC、MHCC-LM3)均購自中國科學院上海細胞生物學研究所。使用含10% FBS的RPMI-1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)L02細胞株；5株肝癌細胞株用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。細胞置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

三、細胞增殖的檢測

采用LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)將miR-504 mimics和inhibitor以及陰性對照轉染HepG2細胞，以CCK8法(上海碧云天生物技術公司)檢測細胞增殖的變化。

四、實時熒光定量PCR

提取組織和細胞中的總RNA，逆轉錄成cDNA。實時熒光定量PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix[寶生物工程 (大連) 有限公司]，取適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL體系進行擴增，每個樣本設置3個平行復孔。由上海吉瑪制藥技術有限公司合成用于特異擴增的miRNAs引物，直接使用目標miRNAs的成熟序列，參照Sanger miRBase數(shù)據(jù)庫。以U6 snRNA作為內參，上實時定量PCR反應儀。miR-504引物上游：5’-AGA CCC TGG TCT GCA CTC TAT C-3’，下游：5’-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3’；U6引物上游：5’-GCA AGG ATG ACA CGC AAA T-3’，下游：5’-GCG AGC ACA GAA TTA ATA CGA C-3’。實驗重復3次，采用2-△△Ct法計算基因表達。

五、統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料的比較采用t檢驗或方差分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、miR-504在肝癌細胞株中的表達

與永生化肝細胞株L02相比，miR-504在5株肝癌細胞株中的表達明顯降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05

圖1miR-504在永生化肝細胞株L02和不同肝癌細胞株中的表達

二、HepG2細胞增殖

轉染miR-504 mimics后，miR-504表達上調了17.89倍，細胞增殖速度減慢；轉染miR-504 inhibitor后，miR-504表達下調了80.81%，細胞增殖加快(圖2)，組間細胞增殖差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

三、miR-504表達與HCC預后的關系

與癌旁組織相比，HCC組織中miR-504表達明顯降低(1.00±0.09對6.74±1.02，P<0.05)。

根據(jù)miR-504表達情況，將HCC患者分為miR-504高表達組 (2-△△Ct>1) 和低表達組 (2-△△Ct≤1)。

**P<0.01

miR-504表達與腫瘤分化程度(P=0.002)、TNM分期(P=0.021)、甲胎蛋白(P=0.012)和門靜脈癌栓(P=0.003)相關，而與患者的性別、年齡、HBV、腫瘤大小、肝硬化、腫瘤數(shù)量無關(表1)。

表1　miR-504表達與HCC患者臨床病理特征的相關性(n)

四、miR-504表達對患者生存時間的影響

Kaplan-Meier分析顯示，miR-504高表達者的生存時間較低表達者明顯延長(χ2=27.246，P<0.001)(圖3)。

圖3miR-504表達與HCC患者生存時間的關系(Kaplan-Meier法)

討論

HCC病情進展極快，且具有發(fā)病隱匿的特點，多數(shù)患者診斷為HCC時已出現(xiàn)了肝內或肝外轉移，從而喪失了接受根治性手術的機會；少部分患者由于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷并接受及時治療而獲得了較長的生存時間[9]。因此，HCC的及時診斷是決定患者治療效果和生存時間的重要因素。目前已有多種分子標記物用于HCC的診斷，但存在敏感性低、特異性不足的問題，因此尋找敏感性好、特異性高的腫瘤標記物是目前肝癌研究領域中迫切需要解決的問題。

miRNAs與人體的生理活動和疾病發(fā)生緊密相關，可作為癌基因或抑癌基因調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[10]。由于miRNAs在不同腫瘤中具有明顯差異的表達模式，因此有望將其作為腫瘤診斷標記物或評估預后[11]。目前研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs參與調節(jié)HCC增殖、凋亡、分化、轉移等多種生物學過程，與HCC的發(fā)生、發(fā)展密切相關，這些異常表達的miRNAs包括miR-1、miR-21、miR-221、miR-222、miR-224、miR-301、let-7a、miR-139a、miR-143、miR-195、miR-26、miR-29和miR-199a/b-3p等[12]。研究報道m(xù)iR-504可靶向抑制抑癌基因p53[13-14]，提示其具有促癌作用；此外，結締組織生長因子(CTGF)可明顯下調miR-504表達，miR-504通過靶向作用于轉錄因子FOXP1促進口腔鱗狀細胞癌的細胞遷移和侵襲[15]；但miR-504可靶向下調細胞周期蛋白依賴性激酶CDK6，抑制下咽部鱗狀細胞癌增殖[6]。上述研究結果差異可能是由于miR-504表達的時序性和組織特異性所致。

然而，miR-504在肝癌中的作用及其機制目前國內外尚未見相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)miR-504在HCC細胞中的表達顯著下降。上調miR-504表達可明顯降低細胞增殖能力，下調表達的作用則相反。為進一步驗證miR-504在HCC中的表達和臨床意義，對85例HCC患者腫瘤組織和癌旁組織中miR-504表達進行檢測，結果顯示腫瘤組織中miR-504表達顯著下調，且與腫瘤分化程度、TNM分期、甲胎蛋白和門靜脈癌栓密切相關，但與性別、年齡、HBV、腫瘤大小、肝硬化和腫瘤數(shù)量無關；miR-504低表達者的生存時間較高表達者明顯縮短。說明miR-504表達在正常肝臟中發(fā)揮重要作用，并與HCC患者預后相關。然而，關于miR-504在HCC中的生物學功能及其具體作用機制有待進一步研究。

參考文獻

1 Lyra-González I, Flores-Fong LE, González-García I, et al. MicroRNAs dysregulation in hepatocellular carcinoma: Insights in genomic medicine[J]. World J Hepatol, 2015, 7 (11): 1530-1540.

2 Song Y, Wang F, Huang Q, et al. MicroRNAs contribute to hepatocellular carcinoma[J]. Mini Rev Med Chem, 2015, 15 (6): 459-466.

3 Xie KL, Zhang YG, Liu J, et al. MicroRNAs associated with HBV infection and HBV-related HCC[J]. Theranostics, 2014, 4 (12): 1176-1192.

4 Notari M, Pulecio J, Raya. Update on the pathogenic implications and clinical potential of microRNAs in cardiac disease[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 105620.

5 Orellana EA, Kasinski AL. MicroRNAs in cancer: A historical perspective on the path from discovery to therapy[J]. Cancers (Basel), 2015, 7 (3): 1388-1405.

6 Kikkawa N, Kinoshita T, Nohata N, et al. microRNA-504 inhibits cancer cell proliferation via targeting CDK6 in hypopharyngeal squamous cell carcinoma[J]. Int J Oncol, 2014, 44 (6): 2085-2092.

7 Hu W, Chan CS, Wu R, et al. Negative regulation of tumor suppressor p53 by microRNA miR-504[J]. Mol Cell, 2010, 38 (5): 689-699.

8 Zhao L, Tang M, Hu Z, et al. miR-504 mediated down-regulation of nuclear respiratory factor 1 leads to radio-resistance in nasopharyngeal carcinoma[J]. Oncotarget, 2015, 6 (18): 15995-16018.

9 Attwa MH, El-Etreby SA. Guide for diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. World J Hepatol, 2015, 7 (12): 1632-1651.

10Ohtsuka M, Ling H, Doki Y, et al. MicroRNA processing and human cancer[J]. J Clin Med, 2015, 4 (8): 1651-1667.

11Hollis M, Nair K, Vyas A, et al. MicroRNAs potential utility in colon cancer: Early detection, prognosis, and chemosensitivity[J]. World J Gastroenterol, 2015, 21 (27): 8284-8292.

12Callegari E, Gramantieri L, Domenicali M, et al. MicroRNAs in liver cancer: a model for investigating pathogenesis and novel therapeutic approaches[J]. Cell Death Differ, 2015, 22 (1): 46-57.

13Soutto M, Chen Z, Saleh MA, et al. TFF1 activates p53 through down-regulation of miR-504 in gastric cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5 (14): 5663-5673.

14Kumar M, Lu Z, Takwi AA, et al. Negative regulation of the tumor suppressor p53 gene by microRNAs[J]. Oncogene, 2011, 30 (7): 843-853.

15Yang MH, Lin BR, Chang CH, et al. Connective tissue growth factor modulates oral squamous cell carcinoma invasion by activating a miR-504/FOXP1 signalling[J]. Oncogene, 2012, 31 (19): 2401-2411.

(2015-08-26收稿；2015-09-19修回)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.04.003

*Email: 2892615414@qq.com