田 甜， 冷 潔， 趙 晶， 高向陽， 宋 超， 高 超

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院2013級，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科

唑來膦酸對人直腸癌COLO320細胞體外增殖和凋亡的影響

田 甜1， 冷 潔1， 趙 晶2， 高向陽2， 宋 超2， 高 超2

1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院2013級，江蘇 徐州 221004； 2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科

目的 探討唑來膦酸(Zoledronic acid，ZOL)對人直腸癌細胞株COLO320體外增殖和凋亡的影響，及其誘導(dǎo)凋亡可能的分子機制。方法 采用CCK-8法檢測不同濃度ZOL作用不同時間對COLO320細胞增殖的影響，并計算半數(shù)致死量(IC50)及增殖抑制率；采用流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)分析ZOL對細胞凋亡的影響；采用Western blotting和實時定量PCR(Real-Time PCR)檢測ZOL作用直腸癌COLO320細胞72 h后相關(guān)凋亡基因Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-9的mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果 與對照組相比，ZOL處理組的直腸癌COLO320細胞增殖受到明顯抑制，呈劑量和時間依賴性(P<0.05)，24、48、72和96 h的IC50分別是209.4、103.6、74.1、65.6 μmol/L；且ZOL對COLO320細胞增殖抑制作用呈時間和濃度依賴性。FCM示不同濃度ZOL處理直腸癌COLO320細胞72 h后的凋亡率較對照組均有不同程度升高，但20 μmol/L濃度組與對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ZOL處理72 h后的COLO320細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2的表達水平下降，Bax、Bad、Caspase-9的表達升高。RT-PCR顯示，Bcl-2 mRNA表達下調(diào)，Bax、Bad、Caspase-9 mRNA表達升高。 結(jié)論 ZOL對人直腸癌COLO320細胞的增殖有抑制作用，對其凋亡有誘導(dǎo)作用。

直腸癌；唑來膦酸；COLO320細胞；增殖；凋亡

唑來膦酸(Zoledronic acid，ZOL)是第3代雙膦酸鹽類藥物，是一種高效破骨細胞抑制劑，臨床上主要用于各種腫瘤骨轉(zhuǎn)移和良性骨病等的治療，并取得了安全可靠的療效[1]。臨床前研究顯示，ZOL除了有抑制骨吸收作用外，還具有直接的體內(nèi)外抗腫瘤作用[2-3]，并與化療藥物協(xié)同抗腫瘤，可以提高其化療療效[4]。理論上，ZOL的作用機制可能為：(1)抗血管生成效應(yīng)[5]；(2)抑制細胞增殖，促進細胞溶解，并誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[6]；(3)抑制腫瘤細胞擴散、浸潤和黏附等。ZOL已被證實對于多種癌細胞系(如肺癌[7]、結(jié)腸癌[8]、胃癌[9]、乳腺癌[6]等)有直接抗腫瘤作用。而其對于直腸癌是否有作用目前鮮有報道。

本實驗通過觀察不同濃度ZOL作用于體外培養(yǎng)人直腸癌COLO320細胞后所導(dǎo)致的腫瘤細胞增殖的影響，及凋亡相關(guān)因子表達水平的變化，探討ZOL對直腸癌COLO320細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人直腸癌COLO320細胞購自武漢大學(xué)細胞庫。

1.2 主要試劑 ZOL粉劑購自Sigma公司；CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(北京天根生化科技有限公司)；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG(HRP標(biāo)記)(北京中杉金橋生物有限公司)；鼠抗人Bcl-2(美國Santa Cruz公司)；兔抗人Bax、Bad(美國Cell Signaling公司)；兔抗人Caspase-9(Bioworld Technology)；RPMI-1640培養(yǎng)基(南京凱基)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；凱基Annexin VFITC/PI細胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)：用含80 U/ml青霉素、0.08 mg/ml鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)COLO320細胞。細胞呈單層貼壁生長。隔天換液，用0.05%胰蛋白酶消化傳代。

1.3.2 CCK-8法檢測ZOL對COLO320細胞增殖的影響：消化、收集處于對數(shù)生長期的細胞，調(diào)成為5×104/ml的單細胞懸液，接種于96孔板，100 μl/孔。24 h后，加入以RPMI-1640培養(yǎng)液配制的ZOL，至終濃度分別為20、40、60、80、100、120 μmol/L。實驗設(shè)含RPMI-1640全培養(yǎng)基的空白對照組和僅經(jīng)濃度調(diào)整但未給予藥物的陰性對照組。每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24、48、72和96 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μl于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，實驗重復(fù)3次，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測光密度(D)值，并計算抑制率。增殖抑制率(%)=(1-實驗組D值/對照組D值)×100%。

1.3.3 流式細胞術(shù)(FCM)細胞調(diào)亡檢測方法：取對數(shù)生長期的COLO320細胞接種于6孔培養(yǎng)板中常規(guī)培養(yǎng)24 h使細胞貼壁生長；以0、20、40、60、80、100、120 μmol/L濃度的ZOL作用COLO320細胞72 h后，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化各組細胞，同樣以不含藥物的培養(yǎng)基作為陰性對照組；加入Binding Buffer懸浮細胞 500 μl/管，并轉(zhuǎn)移到各相應(yīng)的流式檢測管中，加入Annexin V-FITC 5 μl/管，混勻后加入Propidium Iodide 5 μl/管，混勻；室溫下、避光，待反應(yīng)5～15 min后，移入4 ℃保存；在 1 h 內(nèi)，進行FCM檢測。

1.3.4 Western blotting法測定Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白表達水平：COLO320細胞經(jīng)20、60、120 μmol/L濃度ZOL處理72 h后，加入適量裂解液，收集蛋白上清液，取蛋白提取液樣品30 μl上樣于12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜；以脫脂奶粉封閉后，分別于4 ℃以1∶1 000濃度稀釋的Bax、Bad單抗，以1∶500濃度稀釋的Caspase-9及1∶100濃度稀釋的Bcl-2抗體孵育過夜，洗膜后并孵育二抗2 h；用雞冠刺桐凝集素(ECL)顯色。用灰度軟件掃描各組灰度值。

1.3.5 實時定量PCR(Real-Time PCR)測定Bad、Bcl-2、Bax和Caspase-9 mRNA表達水平：COLO320細胞經(jīng)20、60、120 μmol/L濃度ZOL處理72 h后，以TRIzol液提取細胞總RNA，取適量用于反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于實時定量PCR的擴增。目的基因Bad上游引物：5′-CCAGAGTTTGAGCCGAGTGAG-3′，下游引物：5′-GATGATGCTTGCCGGAGCC-3′；Caspase-9上游引物：5′-GCTCCTGGTACGTTGAGACC-3′，下游引物：5′-CACCGAAACAGCATTAGCGAC-3′；Bcl-2上游引物：5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′，下游引物：5′-GAGACAGCCAGGAGAAATCAA-3′；Bax上游引物：5′-ATGGGCTGGACATTGGAC-3′，下游引物：5′-GGGACATCAGTCGCTTCAG-3′；以β-肌動蛋白(actin)為內(nèi)參照，其上游引物：5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物：5′-GTCACCTTCACCGTTCCAGT-3′，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸30 s，共40個循環(huán)。用Applied Biosystems(7500 Real Time PCR System)分析儀進行分析。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測ZOL對COLO320細胞增殖的影響 不同藥物濃度對直腸癌COLO320細胞作用24～96 h后，細胞生長均受到不同程度的抑制，且隨藥物濃度升高抑制作用增強；相同藥物濃度作用不同時間抑制作用不同，且隨作用時間延長，抑制作用增強。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ZOL處理COLO320細胞24、48、72和96 h后的IC50值分別為209.4、103.6、74.1、65.6 μmol/L。根據(jù)IC50數(shù)值，我們選用ZOL作用72 h后做后續(xù)實驗，為了進一步說明其具有濃度依賴性，我們選用20、60和120 μmol/L的藥物濃度做后續(xù)實驗。

2.2 ZOL對直腸癌COLO320細胞凋亡率的影響 用20、60、100及120 μmol/L濃度的ZOL處理直腸癌COLO320細胞72 h后的細胞凋亡率分別為(8.17±2.06)%、(19.80±2.10)%、(28.69±1.97)%、(28.85±1.45)%，與對照組(7.38±1.44)%相比，凋亡率均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但20 μmol/L濃度組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；100及120 μmol/L濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，其余各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1、圖2)。

圖1 ZOL對人直腸癌細胞COLO320增殖的影響

Fig 1 The effects of ZOL on the proliferation of human rectal cells COLO320

2.3 Western blotting法檢測各組COLO320細胞相關(guān)凋亡基因的蛋白表達水平 經(jīng)20、60和120 μmol/L濃度的ZOL處理直腸癌COLO320細胞72 h后，與對照組相比，Bad、Bax及Caspase-9蛋白的表達水平均升高，Bcl-2表達降低，且呈濃度依賴性，不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

圖2 ZOL對直腸癌COLO320細胞凋亡率的影響 A：對照組；B：20 μmol/L濃度組；C：60 μmol/L濃度組；D：100 μmol/L濃度組；E：120 μmol/L濃度組；F：各濃度組

Fig 2 The effects of ZOL on apoptosis rate of COLO320 cells of rectal cancer A:control group;B:20 μmol/L concentration group;C:60 μmol/L concentration group;D:100 μmol/L concentration group;E:120 μmol/L concentration group;F:each concentration group

圖3 ZOL對直腸癌細胞COLO320凋亡相關(guān)蛋白的影響

Fig 3 The effects of ZOL on apoptosis-related proteins of COLO320 cells of rectal cancer

2.4 熒光定量PCR結(jié)果 經(jīng)ZOL處理后，與對照組組相比，各濃度組Bad、Bax及Caspase-9 mRNA的表達水平均升高，Bcl-2 mRNA表達下降，且呈濃度依賴性(見圖4)。與未經(jīng)藥物處理的對照組相比，隨著藥物濃度的升高，20、60和120 μmol/L濃度ZOL處理后：Bad mRNA的表達量分別是對照組的1.41、2.29和3.34倍；Bax mRNA的表達量分別是對照組的1.66、2.14和2.70倍；Bcl-2 mRNA的表達量分別是對照組的87.1%、64.8%、34.1%；Caspase-9 mRNA的表達量分別是對照組的2.45、3.62和4.76倍。

注：與0 μmol/L濃度相比，**P<0.05。

圖4 ZOL對各濃度組相關(guān)凋亡基因mRNA相對表達量影響 A：Bad mRNA表達水平；B:Bax mRNA表達水平;C：Bcl-2 mRNA表達水平；D：Caspase-9 mRNA表達水平

Fig 4 Effect of ZOL on the expression of mRNA in different concentrations A: expression of Bad mRNA; B: expression of Bax mRNA; C: expression of Bcl-2 mRNA; D: expression of Caspase-9 mRNA

3 討論

直腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于胃癌及結(jié)腸癌，好發(fā)于40歲以上男性，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢，目前，直腸癌的根治仍以手術(shù)為主并輔以放化療等綜合治療[10-11]。尋求安全、可靠且副作用小的藥物仍是臨床及科研的主要任務(wù)。

ZOL是第三代雙磷酸鹽類藥物，自開發(fā)上市以來已在80多個國家廣泛應(yīng)用，其安全性得到肯定。ZOL的主要藥理作用是通過抑制破骨細胞的活性和誘導(dǎo)破骨細胞凋亡來抑制骨吸收[12]。研究表明，其可有效控制多種實體瘤的骨相關(guān)事件，如前列腺癌[13-14]、肺癌和其他實體瘤[15-16]。除此之外，ZOL還具有體內(nèi)外抗腫瘤活性作用[2-3]。

Bad、Bax、Bcl-2及Caspase-9在細胞凋亡的線粒體途徑起著重要作用。研究表明在脊椎動物細胞凋亡過程中，線粒體被認為處于凋亡調(diào)控的中心位置，其關(guān)鍵分子是細胞色素C。細胞損傷后，細胞色素C從線粒體釋放，與細胞凋亡激活因子1(Apaf-1)結(jié)合，并活化Caspase-9前體，進一步激活Caspase-3從而引發(fā)Caspases級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細胞凋亡[17-18]。Bcl-2家族在細胞凋亡的線粒體途徑中起著非常重要的調(diào)控作用[19]。Bcl-2家族成員分布廣泛，但大量數(shù)據(jù)表明主要效應(yīng)部位是線粒體。在細胞凋亡過程中，Bcl-2家族促凋亡成員被激活，導(dǎo)致BH3結(jié)構(gòu)域暴露[可能與去磷酸化方式(Bid)或Caspases蛋白水解作用(Bad)等有關(guān)]，引起其構(gòu)象改變，并轉(zhuǎn)移到線粒體[19]。Bax、Bad或Bid轉(zhuǎn)移到線粒體后(Bax在線粒體外膜通過形成離子通道方式促進細胞色素C等蛋白分子釋放)，可引起線粒體釋放大量蛋白質(zhì)，包括細胞色素C。細胞色素C進入線粒體后轉(zhuǎn)化為全細胞色素C，其可以誘導(dǎo)Caspases激活。而Bcl-2和Bcl-xl可直接與Caspases前體聯(lián)結(jié)的Apaf-1相結(jié)合存在于線粒體外膜。通過線粒體-Bcl-2/Bcl-xl-Apaf-1-caspase 9前體四聚體復(fù)合物，對Apaf-1結(jié)構(gòu)進行調(diào)控，這樣，通過抑制細胞色素C的釋放，Bcl-2和Bcl-xl等就可以最終發(fā)揮抑制細胞凋亡作用[20]。可見，Bcl-2表達具有抑制細胞凋亡作用。Bad、Bax及Caspase-9的表達可促進細胞的凋亡。

本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)ZOL處理后的COLO320細胞，與未經(jīng)ZOL處理細胞相比，其Bcl-2 mRNA及其蛋白表達含量均減少，而Bad、Bax及Caspase-9 mRNA及其蛋白表達含量均增多，說明ZOL對直腸癌COLO320細胞的凋亡有促進作用，并推想線粒體途徑可能是ZOL誘導(dǎo)細胞凋亡的重要途徑之一。結(jié)合CCK8結(jié)果分析ZOL對COLO320細胞的增殖有明顯抑制作用。本實驗表明，ZOL對直腸癌有一定的抗腫瘤作用，但本實驗僅限于體外實驗階段，其具體的抗腫瘤作用仍需體內(nèi)實驗進一步探索。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Effects of Zoledronic acid on the proliferation and apoptosis of human rectal cancer COLO320 cells in vitro

TIAN Tian1, LENG Jie1, ZHAO Jing2, GAO Xiangyang2, SONG Chao2, GAO Chao2

1.Grade 2013, Graduate School of Medical sciences, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004; 2.Department of Oncology, the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, China

Objective To investigate the effects and possible mechanisms of Zoledronic acid (ZOL) on the proliferation and apoptosis of human rectal cancer COLO320 cell in vitro.Methods The proliferation of COLO320 cells exposed to different concentrations of ZOL for various periods was examined by the cell counting kit-8(CCK-8), the rate of inhibition and the half maximal inhibitory concentration (IC50) were calulated. Flow cytometry(FCM) showed ZOL induced apoptosis in COLO320 cells. The expressions of Bad, Bcl-2, Bax and Caspase-9 were measured by Western blotting and Real-Time PCR. Results Compared with the control group, ZOL treatment could remarkably inhibit the proliferation of rectal cancer COLO320 cells in a dose-and time-dependent manner (P<0.05). The values of IC50were 209.4 μmol/L for 24 hours, 103.6 μmol/L for 48 hours, 74.1 μmol/L for 72 hours, 65.6 μmol/L for 96 hours. FCM showed that the apoptosis rate of colorectal cancer cells COLO320 72 hours treated with different concentrations of ZOL were increased with different degrees compared with control group, but there was no significant difference between the 20 μmol/L concentration group and the control group (P>0.05), there were statistically significant differences between control group and other groups (P<0.05). Meanwhile, Western blotting and Real-Time PCR results showed that the expression of Bcl-2 was down-regulated and expressions of Bad, Bax and Caspase-9 mRNA were up-regulated at a dose-dependent manner in COLO320 cells.Conclusion ZOL can inhibit the proliferation and induce apoptosis in rectal cancer COLO320 cells in vitro．

Rectal cancer; Zoledronic acid； COLO320 cells; Proliferation; Apoptosis

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.10.024

田甜，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤的綜合治療。E-mail: 814883815@qq.com

高超，教授，碩士生導(dǎo)師，主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤的綜合治療。E-mail: gaochaoly@sina.com

R735.3+7

A

1006-5709(2016)10-1171-05

2016-03-29