鄧玉萍 黃煥森 連肖強(qiáng)

烏司他丁對(duì)大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的影響

鄧玉萍 黃煥森 連肖強(qiáng)

目的 觀察烏司他丁對(duì)大鼠腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)相關(guān)分子表達(dá)的影響。方法 健康SD大鼠90只，隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組(S組,n=30)，腦缺血再灌注組(I/R組,n=30)，烏司他丁處理組(U組,n=30)。采用線栓法制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，缺血2 h，再灌注24 h。HE染色觀察大鼠腦組織病理改變，神經(jīng)功能缺陷評(píng)分評(píng)價(jià)腦損傷程度，2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法檢測(cè)腦梗死體積，末端標(biāo)記法(TUNEL)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡；采用western blot法檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與S組比較，I/R組和U組大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分(NDS)升高(P<0.05)，腦梗死體積增大(P<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增加(P<0.05)，I/R組和U組再灌注24h缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12蛋白均表達(dá)上調(diào)(P<0.05)；與I/R組比較，U組大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損明顯改善(P<0.05)，腦梗死體積減少(P<0.05)，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少(P<0.05)；U組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78表達(dá)上調(diào)幅度明顯大于I/R組、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)上調(diào)幅度明顯小于I/R組(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可明顯減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與增加GRP78蛋白表達(dá)、拮抗CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)啟動(dòng)的凋亡通路有關(guān)。

烏司他?。?內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 腦缺血再灌注

【Author′s address】 The Second Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University,Guangdong Provice. Guangzhou 510260,China

烏司他丁是從健康的成年男性尿液中提取的能抑制多種蛋白水解酶活力的蛋白酶抑制劑[1]，其具有抑制氧自由基的釋放、穩(wěn)定細(xì)胞膜和溶酶體膜、抑制炎性介質(zhì)釋放、改善免疫功能等作用?，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于臨床中，如休克、心肺復(fù)蘇術(shù)后、器官移植及重癥急性胰腺炎等。缺血再灌注損傷是急性腦梗死再通后常見的病理生理過(guò)程，有多項(xiàng)研究表明，烏司他丁能減輕腦缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷等作用[2-4]。本研究采用大鼠腦缺血再灌注模型，觀察烏司他丁是否通過(guò)對(duì)缺血再灌注組織中GRP-78、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)的影響而減輕腦缺血再灌注損傷，進(jìn)一步探討烏司他丁的腦保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

選用健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠90只，體重220～250 g，動(dòng)物由廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。烏司他丁批號(hào)：031409063，規(guī)格每瓶50 000 U。

1.2 分組及給藥方法

將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(S組，n=30)：大鼠只做手術(shù)處理，不行缺血處理；缺血再灌注組(I/R組，n=30)：大鼠行腦缺血后2 h再灌注24 h；烏司他丁處理組 (U組，n=30)：大鼠在再灌注后即刻行尾靜脈注射烏司他丁20萬(wàn)U/kg；S組和I/R組于再灌注后注射等容量生理鹽水。

1.3 動(dòng)物模型的建立

采用線栓法[5]行大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)制備局灶性腦缺血再灌注模型，缺血2 h再灌注。10%水合氯醛(50 mg/kg)麻醉后，仰臥位固定，備皮、酒精消毒，取頸正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈距離分叉口約5 cm處剪一切口，將頂端包有石蠟直徑約0.24 mm的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，調(diào)整魚線深度，插入深度約18～20 mm后固定魚線并縫合，將右側(cè)大腦中動(dòng)脈起始端阻塞，以完全阻斷血供。結(jié)扎入口處，此時(shí)為缺血開始時(shí)間。阻斷血流2 h后，拔除線栓記為再灌注開始時(shí)間。S 組只分離頸總動(dòng)脈，不插入栓線，其余步驟相同。I/R組和U組大鼠行腦缺血后2 h再灌注24 h，98 U組大鼠在缺血再灌注即刻行尾靜脈注射烏司他丁20萬(wàn)U/kg；S組和I/R組于缺血再灌注后注射等容量生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能(NDS)評(píng)分

每組取10只大鼠在缺血再灌注后24 h，觀察大鼠行為學(xué)改變，進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分(NDS)。0分：無(wú)癥狀，活動(dòng)正常；1分：對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直；2分：行走時(shí)向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：無(wú)自發(fā)活動(dòng)，意識(shí)喪失。動(dòng)物模型入選標(biāo)準(zhǔn)：NDS評(píng)分2-3分為模型成功，入組。未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者視為模型制作失敗，不計(jì)入實(shí)驗(yàn)組。神經(jīng)缺陷評(píng)分后進(jìn)行HE染色和腦含水量測(cè)定。

1.5 HE染色

每組取5只大鼠于缺血再灌注24 h后斷頭取腦組織，切片常規(guī)脫蠟，酒精脫水，蘇木伊及伊紅染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察病理結(jié)果。

1.6 大鼠腦梗死體積的測(cè)定

采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride,TTC)法測(cè)定大鼠腦梗塞體積。在腦缺血再灌注后24 h各組分別隨機(jī)取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉下，迅速斷頭取腦。-20℃冰箱內(nèi)冰凍30 min后去除嗅球、小腦及腦干等組織，大腦放于腦模具上切成5片，切片厚度為2 mm，將大腦切片置于2%紅四氮唑(TTC)溶液中，于水浴恒溫37 ℃恒溫避光染色20 min，正常腦組織染成紅色，梗死灶呈白色。期間每5 min翻面1次，再以4%多聚甲醛固定15 min，采用V3.7圖像分析系統(tǒng)測(cè)定腦梗死體積，計(jì)算各組大鼠腦梗死灶的體積比。

1.7 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡

切片常規(guī)脫蠟至水，按照試劑盒步驟操作，常規(guī)封片，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。胞核呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片在400倍下隨機(jī)選取不重疊的6個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.8 western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá)

分別在缺血再灌注24 h取大鼠缺血側(cè)半暗帶區(qū)大腦皮層，western blot檢測(cè)缺血側(cè)大腦皮層GRP78、CHOP、caspase-12蛋白空間表達(dá)情況。每組分別取15只大鼠，每個(gè)蛋白取5只大鼠進(jìn)行測(cè)定。缺血后再灌注24h后取缺血側(cè)大腦皮質(zhì)，用RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE變性凝膠電泳，電泳完畢后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，BSA封閉，GRP78、CHOP和caspase-12抗體(1∶1 000，Santa cruz)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，PBS洗滌三次，ECL顯色。

1.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠的神經(jīng)功能缺陷評(píng)分結(jié)果

S組未見神經(jīng)功能缺陷。在缺血再灌注24 h，I/R組和U組大鼠均出現(xiàn)對(duì)側(cè)前肢不能伸直，行走時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)或傾倒等行為學(xué)改變，神經(jīng)功能缺陷(NDS)評(píng)分均高于S組(P<0.05)；與I/R組比較，U組再灌注24 h的NDS評(píng)分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠神經(jīng)功能缺陷評(píng)分比較 (分，±s)

注：與S組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

2.2 HE染色結(jié)果

S組大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，細(xì)胞排列緊密，胞質(zhì)豐富，核仁清晰，無(wú)變形水腫；I/R組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)稀疏，排列紊亂，出現(xiàn)大量紅色神經(jīng)細(xì)胞，胞核固縮深染，胞體縮小變形，核仁消失，間質(zhì)疏松水腫，胞質(zhì)嗜酸性明顯增強(qiáng)；U組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞較密集，胞體輕微腫脹，細(xì)胞間隙較小，失去極性細(xì)胞，紅色神經(jīng)細(xì)胞較I/R組減少，神經(jīng)細(xì)胞損傷較輕。

2.3 大鼠腦梗塞體積結(jié)果

S組未見腦梗死灶,TTC被線粒體過(guò)氧化氫酶還原，誘發(fā)產(chǎn)生深紅色產(chǎn)物而使正常組織染成紅色。在缺血再灌注24 h，I/R組和U組均可見不同程度的腦梗死灶，與S組比較，I/R組和U組腦梗死體積增大(P<0.05)，與I/R組比較，U組再灌注24h的腦梗死體積顯著減少(P<0.05)，見表2。

表2 三組大鼠缺血再灌注24 h腦梗死體積比的比較±s)

注：與S組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

2.4 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果

S組凋亡細(xì)胞幾乎無(wú)表達(dá)，I/R組凋亡細(xì)胞表達(dá)較S組明顯增加(P<0.05)，U組凋亡細(xì)胞數(shù)較I/R組明顯減少(P<0.05)，見表4。

表3 三組大鼠在缺血再灌注24 h后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 ±s)

注：與S組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

2.5 western blot結(jié)果

與S組比較，I/R組和U組再灌注24h缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，與I/R組比較，U組缺血側(cè)大腦皮質(zhì)GRP78上調(diào)明顯而CHOP和caspase-12蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見表3。

組別NGRP78CHOPCaspase-12S組51.87±0.341.59±0.411.75±0.22I/R組53.44±0.191)12.593±0.611)9.59±0.351)U組58.24±0.181)2)6.89±0.121)2)3.65±0.391)2)

注：與S組比較，1)P<0.05；與I/R組比較，2)P<0.05

3 討論

既往研究證實(shí)，能量代謝障礙、鈣超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應(yīng)、微血管新生影響因素、細(xì)胞凋亡等均參與了腦缺血再灌注損傷[6]。其中，細(xì)胞凋亡是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是一種不同于死亡受體途徑和線粒體途徑的一種新的細(xì)胞凋亡途徑[7]。ERS是機(jī)體對(duì)外界反應(yīng)的一種自我保護(hù)機(jī)制，一定程度的ERS可增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能力，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，保持細(xì)胞生存。但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡(ERAD)，造成組織損傷[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與I/R組比較，應(yīng)用烏司他丁后，腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能缺損明顯改善，腦梗死體積減少，細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少，提示烏司他丁對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)研究中GRP78和CHOP表達(dá)上調(diào)提示缺血再灌注啟動(dòng)了ERS過(guò)程。GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白，屬于熱休克蛋白70系統(tǒng)成員之一，參與蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾，對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、裝配和運(yùn)輸具有重要的作用[10]。組織器官缺血、缺氧、鈣失衡等應(yīng)激狀態(tài)下，可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)大量錯(cuò)誤蛋白蓄積，通過(guò)激活信號(hào)通路促使GRP78早期大量表達(dá)，引發(fā)UPR，以恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[11]。當(dāng)ERS時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失代償，GRP78表達(dá)下降，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ERS引發(fā)的細(xì)胞凋亡可通過(guò)激活下游的凋亡信號(hào)分子產(chǎn)生，包括CHOP和caspase-12[12-13]。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)促凋亡蛋白，生理狀態(tài)下以很低的表達(dá)水平存在于胞漿中，在ERS時(shí)被活化轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，并且表達(dá)大大增加，過(guò)度表達(dá)的CHOP可能通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。張紅菊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠紋狀體缺血后可能通過(guò)GRP78表達(dá)升高啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。宋小燕[16]等研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注可啟動(dòng)ERS，前期(12h)以GRP78表達(dá)上調(diào)為主，后期(24h)逐漸下降；CHOP則在后期大量表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注24小時(shí)后，烏司他丁組GRP78表達(dá)上升幅度明顯大于I/R組，而CHOP表達(dá)上升幅度明顯低于I/R組，提示烏司他丁可能在缺血再灌注后期通過(guò)增加GRP78的表達(dá)，拮抗CHOP的表達(dá)，促進(jìn)保護(hù)性和損害性因子的表達(dá)平衡，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，從而起到腦保護(hù)作用。

ERS引發(fā)細(xì)胞凋亡的另一個(gè)重要途徑是caspase-12途徑。Caspase-12定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是ERS導(dǎo)致凋亡的特異性介質(zhì)，使ERS能夠獨(dú)立誘導(dǎo)凋亡而不依賴于其他通路。caspase-12主要通過(guò)激活caspase-9，caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。吳倩佳等研究發(fā)現(xiàn)烏司他丁可明顯降低腦缺血再灌注中腦組織caspase-3蛋白的表達(dá)[18]，而本研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)，烏司他丁組可明顯降低腦缺血再灌注后腦組織中caspase-12蛋白表達(dá)，減少腦細(xì)胞凋亡，推測(cè)烏司他丁的腦保護(hù)作用機(jī)制之一是通過(guò)抑制caspase-12途徑，進(jìn)而降低caspase-3蛋白表達(dá)，從而減少腦細(xì)胞凋亡的發(fā)生率，也即通過(guò)減輕ERS反應(yīng)來(lái)達(dá)到減輕缺血再灌注損傷

綜上所述，烏司他丁可能通過(guò)上調(diào)GRP78、下調(diào)CHOP和Caspase-12的蛋白水平，減輕ERS反應(yīng)從而抑制細(xì)胞凋亡，達(dá)到減輕缺血再灌注損傷的目的，起到神經(jīng)保護(hù)的作用。本研究為烏司他丁臨床治療腦缺血再灌注損傷提供了又一有力的理論依據(jù)，但有關(guān)烏司他丁在炎癥、細(xì)胞凋亡等方面對(duì)腦缺血再灌注損傷的確切機(jī)制還有待進(jìn)一步的深入研究。

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The Effect of Ulinastatin on Endoplasmic Reticulum Stress Associated Molecules Expressions in Rat Cerebral Cortex After Cerebral Ischemia Reperfusion

DENGYuping,HUANGHuangsen,LIANXiaoqiang

Objective To investigate the protective effects of ulinastatin on express of GRP78、CHOP and caspase-12, the molecules related to endoplasmic reticulum stress(ERS),after ischemia reperfusion injury in rats. Methods Ninety rats were equally randomized into 3 groups(n=30): Sham group (S group,n=30), Ischemia-reperfusion group (I/R group,n=30), Ulinastatin group (U group,n=30). Focal transient cerebral ischemia model was established with intraluminal occlusion fo left meddle cerebral artery. Made through 2 hours of temporary middle cerebral artery occlusion, followed with 24 hours of reperfusion．The pathological results were investigated by HE staining and the cerebral injury situation was evaluated by neurological deficit scores. Infract volume was measured by TTC staining, apoptosis was detected by TdT-mediated dUTP and nick end labeling(TUNEL), and expression of GRP78, CHOP and caspase-12 were meastured by western blot. Results Compared with the S group, the number of apoptotic cells were significantly increase in I/R group and U group (P<0.05); infarct volume and expression of GRP-78, CHOP and caspase-12 were significantly increased in I/R group and U group (P<0.05). The infarct volume and the number of apoptotic cells were significantly less in U group than in I/R group (P<0.05). GRP78 expression was higher in U group than in I/R group (P<0.05), however CHOP and caspase-12 expression was less in U group than in I/R group (P<0.05). Conclusion Ulinastatin has a protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury, which may related to increased GRP78, decreased CHOP and caspase-12 expression and to inhibition of the ERS-induced apoptosis pathway.

Ulinastatin; endoplasmic reticulum stress; ischemia reperfusion

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：2014A020212334); 廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技一般引導(dǎo)項(xiàng)目(編號(hào)：20141A011086)

R589, R363

A

10.3969/j.issn.1671-332X.2016.10.005

鄧玉萍 黃煥森 連肖強(qiáng) ： 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 廣東廣州510260