杜紅巖，周嘉南，潘 峰，楊 華，閆振成，倪銀星，祝之明，鐘 健

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 高血壓內(nèi)分泌科,全軍高血壓代謝病中心,重慶市高血壓研究所，重慶 400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)科研部 生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試中心，重慶 400038)

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定小鼠血清非膽固醇甾醇

杜紅巖1，周嘉南1，潘 峰2，楊 華1，閆振成1，倪銀星1，祝之明1，鐘 健1

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所 高血壓內(nèi)分泌科,全軍高血壓代謝病中心,重慶市高血壓研究所，重慶 400042；2.第三軍醫(yī)大學(xué)科研部 生物醫(yī)學(xué)分析測(cè)試中心，重慶 400038)

目的 本研究旨在建立氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)測(cè)定小鼠血清中非膽固醇甾醇的方法。方法 采集32周齡雄性C57BL/6J小鼠血清，以5α-膽甾烷為內(nèi)標(biāo)，經(jīng)過(guò)氫氧化鉀乙醇溶液皂化、正己烷萃取、硅烷化試劑衍生等步驟，進(jìn)行小鼠血清樣本進(jìn)樣前處理。運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)小鼠血清非膽固醇甾醇進(jìn)行定性及定量分析。配制不同濃度混標(biāo)溶液進(jìn)行GC-MS法分析制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。制備高、中、低濃度混標(biāo)溶液與等量小鼠血清混合處理后測(cè)定非膽固醇甾醇含量，進(jìn)行加標(biāo)回收率、精密度及重復(fù)性試驗(yàn)。采用酶比色法測(cè)定小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)含量。結(jié)果 GC-MS法測(cè)得小鼠血清角鯊烯(squalene)、去氫膽甾醇(desmosterol)、菜油甾醇(campesterol)、豆甾醇(stigmasterin)和β-谷甾醇(β-sitosterol)的含量依次為(4.52±0.94、1.71±1.57、22.17±9.86、0.69±0.05和8.82±3.92)μg/mL；標(biāo)準(zhǔn)化后角鯊烯/TC、去氫膽甾醇/TC、菜油甾醇/TC、豆甾醇/TC和β-谷甾醇/TC，分別為(5.92±2.06、1.89±2.26、26.52±9.54、0.90±0.18和9.08±5.51)μg/mg，平均加標(biāo)回收率依次為95.65%、96.75%、99.14%、103.52%和100.57%，日內(nèi)精密度及重復(fù)性試驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均在5.00%以下。結(jié)論 GC-MS法具有檢測(cè)速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、精密性高和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于實(shí)驗(yàn)小鼠血清非膽固醇甾醇的檢測(cè)，為深入研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物膽固醇合成和吸收的機(jī)制提供研究手段。

氣相色譜；質(zhì)譜；非膽固醇甾醇

膽固醇代謝異常與動(dòng)脈粥樣硬化形成密切相關(guān)，由此引起的心腦血管疾病嚴(yán)重危害人體健康，因此，針對(duì)膽固醇合成與吸收的調(diào)控成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[1-2]。人體中除膽固醇之外的甾醇，通常稱(chēng)為非膽固醇甾醇，其在血清中的含量能夠反映機(jī)體膽固醇合成與吸收狀態(tài)，準(zhǔn)確測(cè)定該類(lèi)物質(zhì)在血清中含量對(duì)深入研究膽固醇代謝的分子機(jī)制至關(guān)重要[1,3]。血清非膽固醇甾醇中的角鯊烯、去氫膽甾醇和7-烯膽烷醇可用于反映機(jī)體內(nèi)源性膽固醇的合成效率；而菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇可用于反映外源性膽固醇的吸收效率[4]。由于該類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)非常相似，一般的化學(xué)方法如毛地黃皂苷法、乙酸酐-濃硫酸比色法等只能測(cè)定固醇類(lèi)物質(zhì)的總量，很難對(duì)多組分的固醇實(shí)現(xiàn)分離定量。色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用能夠更好地將結(jié)構(gòu)相似的不同組分物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，特別是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)法在食品安全、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，引起醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究者的廣泛關(guān)注[5-6]。目前，已有研究報(bào)道采用氣相色譜法測(cè)定人血清非膽固醇甾醇[7-8]，在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中我們常利用小鼠構(gòu)建膽固醇代謝異常模型并進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究，而針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠的血清非膽固醇甾醇的GC-MS測(cè)定方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究建立GC-MS法測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠血清非膽固醇甾醇的方法。

1 材料與方法

1.1 血清樣本采集與儲(chǔ)存 實(shí)驗(yàn)用血清樣本取自8只32周齡雄性C57BL/6J普食喂養(yǎng)小鼠(重慶大坪醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心)，禁食12～16 h，稱(chēng)重后3%異戊巴比妥(0.06 mL/10g)腹腔麻醉，頸動(dòng)脈取血置于分離膠采血管中，室溫靜置1 h后3 000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 min，取血清，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑 主要儀器：BS-124S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，ULTRA MK2實(shí)驗(yàn)用水儀(英國(guó)Veolia Water Systems公司)，7890A氣相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，5975C質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，2k-15低溫離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)，電熱恒溫水溫箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，HYQ-3110震蕩混勻儀(美國(guó)CTI公司，)，BIOBASE系列分立式全自動(dòng)生化分析儀(濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司)。主要試劑：5α-膽甾烷(≥97%)、角鯊烯、去氫膽甾醇、7-烯膽烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇，衍生試劑：N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(MSTFA)、1,4-二硫代赤蘚醇(DTE)、(三甲基硅)甲基碘(TMIS)(均購(gòu)自Sigma公司)；正己烷、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇均系色譜純。

1.3 內(nèi)標(biāo)溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液與衍生試劑配制 以無(wú)水乙醇為溶劑配制濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品和5α-膽甾烷(內(nèi)標(biāo))儲(chǔ)備溶液，-20 ℃保存。配制50 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液進(jìn)行樣品濃度測(cè)定，配制250 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備和加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn)及重復(fù)性試驗(yàn)[9]；將角鯊烯、去氫膽甾醇、7-烯膽烷醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇配制成7種不同濃度的混標(biāo)溶液(見(jiàn)表1)。將MSTFA、DTE、TMIS以5 mL∶10 mg∶10 μL的比例進(jìn)行衍生試劑配制，4 ℃儲(chǔ)存。

表1 各種甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的濃度系列

標(biāo)準(zhǔn)品名稱(chēng)濃度(μg/mL)角鯊烯12562531251255125025去氫膽甾醇125625312512551250257-烯膽烷醇12562531251255125025菜油甾醇12562531251255125025豆甾醇12562531251255125025β-谷甾醇25012562525102505

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 小鼠血清樣本處理 將血清樣本與內(nèi)標(biāo)溶液或混標(biāo)溶液振蕩混勻30 s，加入250 μL的2 mol/L 氫氧化鉀乙醇溶液，振蕩渦旋30 s，放入到60 ℃溫箱，水浴120 min后取出小管，冷卻，渦旋30 s。向小管中加入1 mL的正己烷萃取，渦旋30s，20 ℃ 5 000轉(zhuǎn)/分鐘離心7 min。取上清液移入EP管中，氮吹儀蒸發(fā)、脫水，得殘?jiān)?。加?0 μL衍生試劑，震蕩渦旋30 s，60 ℃，水浴60 min，取出室溫、避光冷卻，取1 μL以備GC-MS分析[9]。

1.4.2 氣相色譜與質(zhì)譜條件 氣相色譜條件：色譜柱為HP-5石英毛細(xì)管柱(325 ℃:30 m×250 μm×0.25 μm)；以高純氦氣(99.999 %)為載氣；設(shè)置初始柱溫200 ℃，保持3 min，程序升溫速率為10 ℃/min ，升至300 ℃，保持7.5 min；設(shè)置進(jìn)樣口溫度為250 ℃；MSD 傳輸線(xiàn)溫度280 ℃；進(jìn)樣口壓力：16.089 psi；不分流模式。質(zhì)譜條件：采用選擇離子檢測(cè)采集模式，溶劑延遲6.00 min，離子源230 ℃，MS四極桿150 ℃。

1.5 分析方法的考察

1.5.1 小鼠血清各非膽固醇甾醇的定性分析 取按照表1配制的混標(biāo)溶液1份，精確加入10 μL 250 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液和100 μL去離子水，按照1.4.1步驟處理后，按照1.4.2條件進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析。記錄色譜圖，對(duì)比各非膽固醇甾醇出峰情況和保留時(shí)間以及目標(biāo)離子。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備 按照表1中的溶液濃度制備系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，各取40 μL，分別加入100 μL去離子水和10 μL 250 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液，處理后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析。以各非膽固醇甾醇與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比對(duì)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程。以各非膽固醇甾醇與內(nèi)標(biāo)物濃度之比為橫坐標(biāo)，非膽固醇甾醇與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 精密量取已配好的高、中、低濃度混標(biāo)溶液(濃度系列見(jiàn)表2)。取已知非膽固醇甾醇含量的小鼠血清3等份，各加入高、中、低濃度的混標(biāo)溶液40 μL，精確量取10 μL 250 μg/mL內(nèi)標(biāo)工作液，處理后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析，連續(xù)進(jìn)樣3次，并計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)回收率(%)=(測(cè)定濃度-本底濃度)/加標(biāo)濃度×100%。

表2 加標(biāo)溶液濃度系列(μg/mL)

標(biāo)準(zhǔn)品名稱(chēng)高濃度中濃度低濃度角鯊烯600300150去氫膽甾醇400200100菜油甾醇720036001800豆甾醇240120060β-谷甾醇25001000500

1.5.4 精密度試驗(yàn) 取1份小鼠血清樣品，精確加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，處理后行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析，連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄各非膽固醇甾醇和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取3份不同小鼠血清樣品，精確加入10 μL內(nèi)標(biāo)工作液，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析，同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄非膽固醇甾醇和內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.6 小鼠血清非膽固醇甾醇含量測(cè)定 取8個(gè)處理后的小鼠血清樣品，每個(gè)樣品各取1 μL，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析，記錄峰面積，計(jì)算小鼠血清非膽固醇甾醇含量。

1.7 小鼠血清非膽固醇甾醇含量標(biāo)準(zhǔn)化處理 全自動(dòng)生化分析儀酶比色法測(cè)定小鼠血清總膽固醇(total cholesterol,TC)，運(yùn)用小鼠血清各非膽固醇甾醇含量與TC的比值進(jìn)行結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清各非膽固醇甾醇的定性分析 GC-MS法測(cè)出小鼠血清中各種非膽固醇甾醇的保留時(shí)間依次為：角鯊烯12.1 min，5α-膽甾烷12.4 min，去氫膽甾醇15.1 min，7-烯膽烷醇15.3 min，菜油甾醇15.7 min，豆甾醇16.1 min，β-谷甾醇16.7 min(見(jiàn)圖1)。目標(biāo)離子(m/z)依次為69、217、343、458、343、484、357。

a:角鯊烯； b:5α-膽甾烷； c:去氫膽甾醇； d:7-烯膽烷醇； e:菜油甾醇； f:豆甾醇； g:β-谷甾醇。圖1 各非膽固醇甾醇標(biāo)準(zhǔn)品衍生后的GC-MS圖譜

2.2 各非膽固醇甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程 各個(gè)非膽固醇甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程(見(jiàn)表3)，R2在0.991～1.000，結(jié)果顯示各甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性相關(guān)性良好。

2.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 本研究中角鯊烯、去氫膽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇的平均加標(biāo)回收率依次為95.65%、96.75%、99.14%、103.52%、100.57%，RSD在1.73%～7.83%，RSD<8.00%，提示本方法準(zhǔn)確度良好(見(jiàn)表4)。

表3 各種甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的曲線(xiàn)方程

甾醇名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程R2角鯊烯Y=00731X-004230992去氫膽甾醇Y=00291X+0013609997-烯膽烷醇Y=00412X-0006861000菜油甾醇Y=00399X+001190997豆甾醇Y=00130X-0004120999β-谷甾醇Y=00505X+004150991

表4 小鼠血清非膽固醇甾醇加標(biāo)回收率

甾醇名稱(chēng)本底濃度(μg/mL)加標(biāo)濃度(μg/mL)測(cè)定濃度(μg/mL)平均加標(biāo)回收率(%)加標(biāo)回收率RSD(%)角鯊烯4．251．505．6795．654．301．505．641．505．773．007．223．007．283．007．206．009．956．009．746．009．49去氫膽甾醇1．941．002．8496．751．731．002．911．002．922．003．872．003．972．003．884．005．884．005．704．005．87

續(xù)表

甾醇名稱(chēng)本底濃度(μg/mL)加標(biāo)濃度(μg/mL)測(cè)定濃度(μg/mL)平均加標(biāo)回收率(%)加標(biāo)回收率RSD(%)菜油甾醇37．6818．0056．3099．147．8318．0055．5818．0057．0936．0068．2436．0071．7736．0070．4272．00111．5672．00105．7972．00119．64豆甾醇0．760．601．41103．523．460．601．310．601．371．201．981．202．001．201．992．403．362．403．252．403．41β-谷甾醇12．645．0018．14100．573．365．0017．685．0017．7310．0022．4010．0022．6010．0022．9225．0038．2125．0036．0425．0036．81

2.4 精密度試驗(yàn) 同一血清樣品處理后連續(xù)進(jìn)樣3次，各非膽固醇甾醇對(duì)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.67%～2.52%，RSD<5.00%，表明該方法精密度較好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 同一處理批次血清樣品連續(xù)進(jìn)樣3次，各非膽固醇甾醇對(duì)內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值的RSD在1.29%～3.65%，RSD<5.00%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.6 小鼠血清非膽固醇甾醇測(cè)定結(jié)果 小鼠血清非膽固醇甾醇含量結(jié)果(見(jiàn)表5)，平均膽固醇含量為0.80 mg/mL。并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示：除7-烯膽烷醇未檢測(cè)出，其他非膽固醇甾醇均可測(cè)出。

名稱(chēng)化合物濃度化合物/總膽固醇μg/mg角鯊烯(μg/mL)452±094角鯊烯/總膽固醇592±206去氫膽甾醇(μg/mL)171±157去氫膽甾醇/總膽固醇189±226菜油甾醇(μg/mL)2217±986菜油甾醇/總膽固醇2652±954豆甾醇(μg/mL)069±005豆甾醇/總膽固醇090±018β-谷甾醇(μg/mL)882±392β-谷甾醇/總膽固醇908±551總膽固醇(mg/mL)080±016——————

3 討論

膽固醇代謝異常可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成，進(jìn)而引起心腦血管疾病。改善膽固醇異常代謝、延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展已成為目前脂類(lèi)代謝研究的熱點(diǎn)之一[2]。膽固醇在機(jī)體中的來(lái)源分為合成和吸收兩個(gè)部分，臨床上多采用酶比色法測(cè)定血清膽固醇水平，然而膽固醇的升高并不能反映究竟是機(jī)體膽固醇合成或是吸收異常，目前主要使用非膽固醇甾醇來(lái)反映機(jī)體膽固醇代謝平衡，主要包括：血清膽固醇合成標(biāo)志物(如角鯊烯、去氫膽甾醇、7-烯膽烷醇)及膽固醇吸收標(biāo)志物(如菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇)。因生物體中上述固醇類(lèi)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似且含量甚微，故對(duì)其化合物的定性與定量的精確分析成為研究的關(guān)鍵[1]。本研究建立GC-MS測(cè)定小鼠血清非膽固醇甾醇的方法，為深入研究膽固醇代謝機(jī)制提供技術(shù)手段。

目前測(cè)定血清非膽固醇甾醇的方法主要有氣相色譜法和液相色譜法，但液相色譜法不能有效分離菜油甾醇與豆甾醇[10-11]。氣相色譜法具有靈敏度高、選擇性好，能有效分離結(jié)構(gòu)相近物質(zhì)和多組分混合物的優(yōu)點(diǎn)，且分析速度快、操作簡(jiǎn)單；質(zhì)譜分析檢測(cè)范圍廣、分辨率高；二者聯(lián)用更能提高檢測(cè)的精密度和定量的準(zhǔn)確性[12]。本研究建立的GC-MS測(cè)定小鼠血清非膽固醇甾醇的方法，在操作過(guò)程中特別注意到了以下幾點(diǎn)：①為減少操作誤差、避免溶劑揮發(fā)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們參照文獻(xiàn)報(bào)道[8]，采用內(nèi)標(biāo)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法對(duì)小鼠血清非膽固醇甾醇含量進(jìn)行測(cè)定；②考慮到人與小鼠存在種屬差異，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作時(shí)選用了比以往報(bào)道[7]更寬的線(xiàn)性范圍；③在實(shí)驗(yàn)中，我們采用選擇性離子掃描技術(shù)，確保所測(cè)目標(biāo)峰為特定非膽固醇甾醇，提高了特異性。

本研究中，各物質(zhì)平均加標(biāo)回收率均在95.65%～103.52%，RSD均在8.00%以?xún)?nèi)，說(shuō)明本測(cè)定方法的準(zhǔn)確度較好；同日內(nèi)精密度以及重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均在5.00%以下，說(shuō)明該方法的精密度較高、重復(fù)性較好。因血清中的非膽固醇甾醇含量較低，在體內(nèi)由脂蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，為消除脂蛋白含量變化對(duì)非膽固醇甾醇檢測(cè)結(jié)果的影響，依據(jù)國(guó)內(nèi)外報(bào)道[3,13]，本研究采用非膽固醇甾醇與總膽固醇的比值對(duì)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)小鼠血清中7-烯膽烷醇未被檢測(cè)出，這與國(guó)內(nèi)報(bào)道一致[13]，可能系小鼠血清中7-烯膽烷醇的含量甚微或是不存在，同時(shí)，測(cè)定結(jié)果表明小鼠體內(nèi)反映膽固醇合成和吸收的標(biāo)志物種類(lèi)與人體基本一致[3]。

綜上所述，我們建立了GC-MS法測(cè)定小鼠血清中非膽固醇甾醇的方法，該方法具有檢測(cè)時(shí)間較短、靈敏度高、特異性好、精密性高等特點(diǎn)，為深入進(jìn)行小鼠膽固醇合成與吸收的研究提供了可靠的檢測(cè)手段，為更好地在科學(xué)實(shí)驗(yàn)中以小鼠為模型深入研究人體膽固醇代謝機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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收稿2016-10-11;修回2016-11-09〗

(編輯：譚秀榮)

Determination of non-cholesterol sterols in mouse serum by gas chromatograph-mass spectrometer

DuHongyan1,ZhouJianan1,PanFeng2,YangHua1,YanZhencheng1,NiYinxing1,ZhuZhiming1,ZhongJian1

(1.Department of Hypertension and Endocrinology,Institute of Hypertension Research,Daping Hospital of the Third Military Medical University,Chongqing 400042,China; 2.Biomedical Analysis Center,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China)

Objective To establish a method of gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS) to determine the non-cholesterol sterols in mouse serum.Methods Serum samples collected from male mice aged 32 weeks were preprocessed by saponification with potassium hydroxide ethanol solution,extraction by hexane,and derivation by silylation reagents with 5α-cholestane as an internal standard.The non-cholesterol sterols content in mouse serum were determined by GC-MS.Different concentrations of mixed standard solutions by GC-MS analysis were made for the standard curve.Three different concentrations of mixed standard solutions were put into the same amount of mouse serum,and were used to determine the content of non-cholesterol sterols by GC-MS for the recoveries， precision and repetition test.The serum total cholesterol (TC) was determined by enzyme colorimetric method.Results The contents of squalene,desmosterol,campesterol,stigmasterin and β-sitosterol by GC-MS were as follows(4.52±0.94,1.71±1.57,22.17±9.86,0.69±0.05 and 8.82±3.92)μg/mL,respectively.The results were standardized as ratio to TC (total cholesterol).Squalene/TC,desmosterol/TC,campesterol/TC,stigmasterin/TC and β-sitosterol/TC were as follows(5.92±2.06,1.89±2.26,26.52±9.54,0.90±0.18 and 9.08±5.51)μg/mg.The mean recoveries of the non-cholesterol sterols were between 95.65% and 103.52%.The intra-day RSDs of precision and repetition test were both below 5.00%.Conclusion GC-MS can be used for quickly measuring serum non-cholesterol sterols of mouse with high sensitivity，specificity and reproducibility.This method will provide a reliable basis for further study of the mechanisms of cholesterol synthesis and absorption in experimental animals.

gas chromatograph； mass spectrometer； non-cholesterol sterols

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81270005)。

鐘健，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌與代謝病，E-mail:515285051@qq.com；祝之明，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管、內(nèi)分泌與代謝病，E-mail:zhuzm@yahoo.com。

R589.2

A

1000-2715(2016)06-0617-06