付 浩，楊小颯，余東堃，閆海洋，孫圣凱，陳孝儲(chǔ)，程世翔，涂 悅，王志宏

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 腦科中心，天津 300162；2.武警8731部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，廣東 廣州 510800；3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

凋亡抑制劑zVAD對(duì)腦缺血再灌注小鼠外周血線粒體DNA拷貝數(shù)的影響

付 浩1,3，楊小颯1,3，余東堃2，閆海洋1,3，孫圣凱1，陳孝儲(chǔ)1，程世翔1,3，涂 悅1,3，王志宏1

(1.武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院 腦科中心，天津 300162；2.武警8731部隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)，廣東 廣州 510800；3.天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

目的 探討凋亡抑制劑zVAD對(duì)腦缺血再灌注小鼠線粒體DNA拷貝數(shù)的影響。方法 80只雄性25～30 g C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型組(3組共24只)、模型給藥組(3組共24只)、假手術(shù)組(3組共24只)和對(duì)照組(8只)。MCAO模型組應(yīng)用線栓法，構(gòu)建小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型并在1 h后進(jìn)行再灌注，模型給藥組在再灌注前腹腔注射10 mmol/L的 zVAD 10 mL/kg，假手術(shù)組暴露頸內(nèi)動(dòng)脈后縫合皮膚，對(duì)照組不進(jìn)行任何操作。分別于再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72 h)，對(duì)經(jīng)手術(shù)操作的每組各8只小鼠進(jìn)行改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分(mNSS)，評(píng)分后取血約200 μL并提取外周血基因組DNA，real-time PCR法檢測(cè)相對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)。結(jié)果 MCAO模型組和模型給藥組術(shù)后24、48和72 h的mNSS評(píng)分均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后48、72 h，模型給藥組mNSS評(píng)分均明顯低于相應(yīng)MCAO模型組(P<0.05)；術(shù)后24、48 h，MCAO模型組和模型給藥組線粒體DNA拷貝數(shù)均高于對(duì)照組或假手術(shù)組，模型給藥組高于MCAO模型組(P<0.05)；術(shù)后72 h，各組的線粒體DNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.58，P>0.05)。結(jié)論 凋亡抑制劑zVAD對(duì)腦缺血再灌注小鼠可起到一定的腦保護(hù)作用，這可能由于zVAD抑制了線粒體介導(dǎo)的凋亡通路，并通過(guò)端?！€粒體途徑促進(jìn)了外周血線粒體DNA拷貝數(shù)的升高。

凋亡抑制劑；腦缺血再灌注；線粒體DNA拷貝數(shù)；改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分

近些年來(lái)，缺血性腦卒中發(fā)病率逐年上升，已成為導(dǎo)致我國(guó)成人死亡或殘疾的主要原因之一，但卒中患者認(rèn)知功能的轉(zhuǎn)歸是高度可變的，若能在早期進(jìn)行有效干預(yù)，對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要[1-2]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)拷貝數(shù)的變化與腦缺血再灌注小鼠的神經(jīng)功能損傷癥狀密切相關(guān)，以線粒體為靶點(diǎn)或可改善神經(jīng)功能損傷癥狀[3]。N-苯甲基氧化碳酰-纈氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氟化丙酮( benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，zVAD)是一種人工合成的凋亡抑制劑，本研究旨在探討zVAD是否可以對(duì)腦缺血再灌注小鼠的mtDNA拷貝數(shù)起到穩(wěn)定作用，并改善神經(jīng)損傷癥狀，從而為缺血性腦卒中的機(jī)制研究和藥物治療提供更多基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性C57BL/6小鼠80只，體質(zhì)量25～30 g(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)。

1.2 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)，實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增試劑盒(北京康為世紀(jì)公司)，zVAD(100 mmol/L溶于1 mL DMSO，美國(guó)Sigma公司)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀(美國(guó)ABI公司，StepOne Plus)，桌面小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及相應(yīng)手術(shù)操作 將小鼠隨機(jī)分為10組，包括大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型組(3組共24只)、模型給藥組(3組共24只)、假手術(shù)組(3組共24只)和對(duì)照組(8只)。將除對(duì)照組以外的小鼠以3%濃度異氟烷誘導(dǎo)麻醉，隨后以400 mL/min的氣體流量，2%異氟烷持續(xù)麻醉。MCAO模型組應(yīng)用線栓法構(gòu)建右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞模型，1 h后拔出線栓完成再灌注[4]。模型給藥組于拔出線栓后立即腹腔注射經(jīng)生理鹽水稀釋為10 mmol/L的 zVAD 10 mL/kg。假手術(shù)組僅暴露頸內(nèi)動(dòng)脈后，縫合切口。對(duì)照組不進(jìn)行任何操作。

1.3.2 MCAO模型構(gòu)建評(píng)價(jià) 麻醉清醒后小鼠出現(xiàn)以下三種狀態(tài)之一則認(rèn)為MCAO造模成功：不能完全伸展單側(cè)前肢(輕度神經(jīng)功能損傷癥狀)；向單側(cè)轉(zhuǎn)圈(中度神經(jīng)功能損傷癥狀)；向單側(cè)傾斜(重度神經(jīng)功能損傷癥狀)[4]。

1.3.3 神經(jīng)功能損傷評(píng)分及標(biāo)本采集 手術(shù)操作完成后，MCAO模型組、模型給藥組和假手術(shù)組均于術(shù)后第24、48和72小時(shí)，各隨機(jī)取8只小鼠入組行mNSS評(píng)分[5]，分?jǐn)?shù)越高說(shuō)明癥狀越嚴(yán)重，正常為0分，損傷癥狀最嚴(yán)重為18分。評(píng)價(jià)后立即采用頸椎離斷法處死小鼠，并迅速摘眼球取血200 μL至1.5 mL EP管內(nèi)。對(duì)照組于手術(shù)操作完成后72 h進(jìn)行評(píng)分與取材，方法同上。

1.3.4 mtDNA拷貝數(shù)測(cè)定 按照基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取基因組DNA。參考Snowdin和Hehar[6-7]的方法設(shè)計(jì)線粒體單拷貝基因(COXⅠ)和內(nèi)參基因(36B4)的引物。COXⅠ，F(xiàn)鏈：TAATTCGAGCTGAACTAGGAC，R鏈：TACAAGTCAGTTCCCGAAGC；36B4，F(xiàn)鏈：CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC，R鏈：CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。采用25 μL PCR反應(yīng)體系，其中含25 ng基因組DNA，各引物終濃度均為400 nmol/L。采用兩步法擴(kuò)增：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)，應(yīng)用2-ΔΔCt法得出相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能損傷評(píng)分 MCAO模型組和模型給藥組術(shù)后24、48和72 h的mNSS評(píng)分均明顯高于相應(yīng)對(duì)照組(P<0.05)，術(shù)后48和72 h，模型給藥組mNSS評(píng)分均明顯低于相應(yīng)MCAO模型組(P<0.05，見(jiàn)圖1)。

MCAO為大腦中動(dòng)脈栓塞；mNSS為改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分；*：與同時(shí)間假手術(shù)組比較，P<0.05；**與同時(shí)間其他兩組比較，P<0.05。 圖1 各組小鼠術(shù)后神經(jīng)功能損傷評(píng)分比較

2.2 mtDNA拷貝數(shù)變化 術(shù)后24 h，MCAO模型組和模型給藥組mtDNA拷貝數(shù)均高于對(duì)照組或假手術(shù)組(F=56.32，P<0.05)，模型給藥組高于MCAO模型組(19.21±4.09 vs.10.41±4.68，P<0.05)；術(shù)后48 h，MCAO模型組和模型給藥組mtDNA拷貝數(shù)均高于對(duì)照組或假手術(shù)組(F=24.26，P<0.05)，模型給藥組高于MCAO模型組(16.07±3.85 vs.9.68±6.81，P<0.05)；術(shù)后72 h，各組的mtDNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.58，P>0.05，見(jiàn)圖2)。

MCAO為大腦中動(dòng)脈栓塞；*：與同時(shí)間其他各組比較，P<0.05。 圖2 各組小鼠術(shù)后相對(duì)mtDNA拷貝數(shù)變化

3 討論

zVAD是一種人工合成的化合物，由于其可抑制caspase家族的蛋白酶活性，常被作為凋亡抑制劑應(yīng)用于各領(lǐng)域的研究。本實(shí)驗(yàn)中小鼠腦缺血再灌注后應(yīng)用zVAD，從第2天起即可見(jiàn)到神經(jīng)功能損傷癥狀的顯著改善，表明zVAD具有一定的腦保護(hù)作用。這與Inoue和Lin等的研究結(jié)果一致。Inoue等[8]發(fā)現(xiàn)zVAD可減少缺血再灌注大鼠模型的腦梗死面積，與異氟醚合用時(shí)，還可減少神經(jīng)元的遲發(fā)性死亡。Lin等[9]發(fā)現(xiàn)zVAD可有效改善腦缺血導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)損傷癥狀，這可能是由于zVAD阻斷了caspase介導(dǎo)的凋亡通路，一定程度上減輕了腦組織缺血缺氧損傷后的凋亡，從而發(fā)揮了腦保護(hù)作用。但除此之外還有哪些更為具體的機(jī)制參與其中，尚不明朗。

mtDNA是線粒體內(nèi)獨(dú)立的環(huán)狀基因組DNA，其在基因組之中的個(gè)數(shù)稱為mtDNA拷貝數(shù)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中每個(gè)線粒體內(nèi)含2～10個(gè)DNA拷貝[10]。由于缺少組蛋白的保護(hù)，mtDNA易受到氧化應(yīng)激、炎癥等因素的損傷，造成基因突變，并發(fā)生功能障礙[11]。但線粒體內(nèi)基因修復(fù)系統(tǒng)的效率很低，機(jī)體維持mtDNA功能完整性的主要機(jī)制是誘導(dǎo)mtDNA拷貝數(shù)的增加[12]，進(jìn)而維持機(jī)體的能量供應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)中，腦缺血再灌注小鼠在第24、48小時(shí)，mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，表明mtDNA發(fā)生了代償性增加，這可能是線粒體的損傷與修復(fù)綜合作用的結(jié)果：一方面，腦缺血再灌注使機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，并導(dǎo)致Ca2+在線粒體內(nèi)聚集，造成線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔持續(xù)開(kāi)放，線粒體膜電位降低，從而激活線粒體的凋亡通路[13- 14]。另一方面，當(dāng)局部能量供應(yīng)不足導(dǎo)致活性氧族在體內(nèi)蓄積時(shí)，可觸發(fā)呼吸核因子和線粒體轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，促進(jìn)線粒體的增殖以代償損傷mtDNA造成的供能不足[15]。當(dāng)應(yīng)用zVAD后，與MCAO模型組小鼠比較，mtDNA拷貝數(shù)進(jìn)一步增加，神經(jīng)功能損傷癥狀明顯減輕，表明zVAD可促進(jìn)mtDNA的代償性修復(fù)。這可能是由兩方面原因造成的：①zVAD降低了mtDNA損傷。zVAD可通過(guò)抑制caspase-3和caspase-9，一定程度上阻斷線粒體凋亡通路，降低了細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，起到了線粒體保護(hù)作用[16- 17]。②zVAD保障了mtDNA的復(fù)制。研究表明，zVAD可通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)γ-干擾素(INF-γ)的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，使PGC1α表達(dá)增加，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄共激活劑PGC發(fā)揮作用，保障mtDNA拷貝數(shù)代償性增加[18-20]。在術(shù)后72 h，各組mtDNA拷貝數(shù)基本恢復(fù)正常，表明線粒體損傷與修復(fù)的失衡主要發(fā)生在缺血性腦卒中疾病的急性期，提示臨床治療中若以線粒體為靶點(diǎn)進(jìn)行藥物干預(yù)，應(yīng)在疾病發(fā)生初期進(jìn)行。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腦缺血再灌注小鼠應(yīng)用凋亡抑制劑zVAD，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)疾病初期線粒體DNA拷貝數(shù)的代償性增加，并改善神經(jīng)功能損傷癥狀，為缺血性腦卒中的機(jī)制研究和藥物治療提供了更多的基礎(chǔ)支撐。但mtDNA 拷貝數(shù)變化受環(huán)境、遺傳等因素影響，其中氧化應(yīng)激作用是重要因素之一，不同因素對(duì)mtDNA 拷貝數(shù)具體調(diào)控機(jī)制有待更多的研究去闡明，如何根據(jù)mtDNA 拷貝數(shù)的變化對(duì)疾病的發(fā)生、發(fā)展做出預(yù)測(cè)及恰當(dāng)治療,也將是今后研究的重要方向。

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收稿2016-10-13;修回2016-11-11〗

(編輯：王靜)

Influence of the apoptosis inhibitor zVAD on peripheral mitochondrial DNA copy number in cerebral ischemia and reperfusion mice

FuHao1,3,YangXiaosa1,3,YuDongkun2,YanHaiyang1,3,SunShengkai1,ChenXiaochu1,ChengShixiang1,3,TuYue1,3,WangZhihong1

(1.Brain Hospital of Affiliated Hospital of Logistics College of PAP,Tianjin 300162,China; 2.Medical Team of the 8731 Unit of PAP,Guangzhou Guangdong 510800，China; 3.Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair,Tianjin 300162,China)

Objective To explore the influence of the apoptosis inhibitor zVAD on peripheral mitochondrial DNA copy number in cerebral ischemia reperfusion mice.Methods 80 male C57BL/6 mice were randomly divided into middle cerebral artery occlusion (MCAO) group (24 mice divided into 3 group equally),drug given group (24 mice divided into 3 group equally),sham group (24 mice divided into 3 group equally) and control group (8 mice).MCAO group were conducted by the intraluminal filament technics and reperfusion was made 1h later.Drug given group was given 10 mmol/L zVAD 10 mL/kg by peritoneal injection.Sham group were conducted with an incision on skin of neck and sewed it immediately,no operations were carried out in control group.At different time after operation (24 h,48 h,72 h),neurological function was evaluated according to the modified Neurological Severity Score (mNSS),genomic DNA was extracted from 200 μl blood.Mitochondrial DNA copy number was measured by real-time PCR.Results The mNSS of either MCAO group or drug given group were higher than sham group at 24 h,48 h and 72 h (allP<0.05).The mNSS of drug given group were significantly lower than MCAO group at 48 h and 72 h (allP<0.05).At 24 h and 48 h,the mitochondrial DNA copy number of MCAO group and drug given group mice were increased when compared with sham group or control group,with the drug given group was the highest among the four groups (allP<0.05),but there was no significant difference among the four groups at 72h (P>0.05).Conclusion The apoptosis inhibitor zVAD can play a protective role on neurological function in cerebral ischemia reperfusion mice.The potential reason may be that zVAD inhibited the mitochondria-mediated apoptotic pathway,as well as promoted the increase of mitochondrial DNA copy number via telomeres-mitochondria pathway.

apoptosis inhibitor; cerebral ischemia and reperfusion; mitochondrial DNA copy number; Modified Neurological Severity Score (mNSS)

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項(xiàng)目(NO：2015KZ126)；天津市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)中醫(yī)中西醫(yī)結(jié)合科研課題(NO：2015155)；天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金資助項(xiàng)目(NO：WYKFZ201602)；武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(NO：WHJ2015013)；武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院種子基金資助項(xiàng)目(NO：FYM201517、NO：FYQ201560)。

王志宏，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：老年醫(yī)學(xué)，E-mail:yjb_office@126.com。

R743

A

1000-2715(2016)06-0593-04