陶 冬，鄧 妍，張 蓓，羅 英，范奇元

(1.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院毒理學教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州省畢節(jié)市第一人民醫(yī)院 全科醫(yī)學科，貴州 畢節(jié) 551700；3.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 骨一科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校 衛(wèi)生管理系，貴州 遵義 563000)

基礎醫(yī)學研究

錳對大鼠紋狀體神經(jīng)細胞PARK2表達的影響

陶 冬1，鄧 妍2，張 蓓3，羅 英1，范奇元4

(1.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院毒理學教研室，貴州 遵義 563099；2.貴州省畢節(jié)市第一人民醫(yī)院 全科醫(yī)學科，貴州 畢節(jié) 551700；3.貴州省遵義市第一人民醫(yī)院 骨一科，貴州 遵義 563000；4.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校 衛(wèi)生管理系，貴州 遵義 563000)

目的 研究錳在RNA干擾條件下對大鼠紋狀體神經(jīng)細胞PARK2基因的影響。方法 使用不同濃度(0、100、300和500 μmol/L)的錳處理感染PARK2 shRNA的原代大鼠紋狀體神經(jīng)元細胞24 h，采用實時熒光定量和蛋白印跡法檢測PARK2基因mRNA水平和蛋白質(zhì)表達的變化。結(jié)果 在單純感染慢病毒的紋狀體神經(jīng)細胞處理組中，不同錳處理濃度組與對照組比較，300和500 μmol/L錳濃度處理24 h后，PARK2 mRNA及蛋白表達顯著下降(P<0.01)。在感染慢病毒shRNA的紋狀體神經(jīng)細胞處理組中：不同錳處理濃度與對照組比較，PARK2 mRNA(P<0.01)及蛋白表達均顯著下降(P<0.05)。結(jié)論 轉(zhuǎn)染慢病毒載體PARK2 shRNA的紋狀體神經(jīng)元細胞染錳24 h后進一步降低了PARK2 mRNA和蛋白的表達，該作用過程可能是錳致神經(jīng)系統(tǒng)危害的作用機制之一。

錳；神經(jīng)細胞；PARK2；shRNA

錳是一種重要的人體必需微量元素，參與體內(nèi)多種酶的構(gòu)成，影響到機體的糖、蛋白質(zhì)和脂類代謝。同時，錳也是生活和生產(chǎn)環(huán)境中常見的重金屬毒物，由于金屬在環(huán)境中的不可消除性，錳在環(huán)境的存留時間長，通過不同的途徑和化合物類型進入機體。我國是錳合金生產(chǎn)和使用大國，特別是隨著燃油汽車數(shù)量迅速增長，曾經(jīng)廣泛使用的汽油抗爆劑四乙基鉛已被有機錳取代，導致錳對環(huán)境的污染越來越嚴重[1]。人如果長時間生活在高濃度猛的環(huán)境中則可引起錳中毒。體內(nèi)過多的錳蓄積，可對多個系統(tǒng)產(chǎn)生危害，但主要危害神經(jīng)系統(tǒng)[2-3]。因此，錳中毒的防治，特別是錳對神經(jīng)系統(tǒng)危害的防治已成為公共衛(wèi)生領(lǐng)域的棘手問題。

PARK2基因的表達產(chǎn)物為Parkin蛋白，其主要功能是清除沉積于細胞內(nèi)的錯誤折疊蛋白，該功能的正常發(fā)揮是細胞生存的不可或缺環(huán)節(jié)。PARK2基因功能的發(fā)揮與其產(chǎn)物在E3泛素連接酶中的作用密切相關(guān)[4]。Parkin在多巴胺能神經(jīng)元細胞中防止α-突觸核蛋白折疊和聚集，對神經(jīng)細胞具有保護作用。PARK2基因的突變，產(chǎn)生異常Parkin或Parkin水平降低，可促進α-突觸核蛋白折疊和聚集，引起神經(jīng)細胞死亡，是產(chǎn)生AR-JP的主要原因之一[5]。

我們前期的研究結(jié)果顯示，錳接觸可降低PARK2基因在血液中的表達，該過程可能是錳所引起神經(jīng)中毒的作用機制之一，故此，本文擬在細胞水平通過RNA干擾技術(shù)進一步明確其對神經(jīng)細胞PARK2基因表達的影響，為研究錳中毒神經(jīng)系統(tǒng)損害的機制及生物標志物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 本實驗所用動物為清潔級動物，購買自第三軍醫(yī)大學，成年雌雄SD大鼠[生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005]繁殖的子代大鼠作為實驗使用的神經(jīng)細胞材料來源。

1.1.2 藥品與試劑 shRNA慢病毒載體構(gòu)建由上海吉滿公司完成，PCR檢測相關(guān)試劑購于美國Fermentas公司，Western blot檢測所使用的相關(guān)試劑采購于上海碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma 370)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯，CKX41)，實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad，CFX96)。

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)細胞的分離與培養(yǎng) 雌雄大鼠交配后，取1 d齡新生SD大鼠，無菌條件下取完整腦組織， 置于D-hanks平衡鹽溶液中，分離出紋狀體，將紋狀體剪成直徑為1 mm3左右小塊。在0.125% g/L胰酶消化20 min，過濾，離心分離獲得紋狀體神經(jīng)細胞。培養(yǎng)板中使用的細胞濃度為1×106個/mL，接種于預處理(包被)過的細胞培養(yǎng)板，細胞培養(yǎng)條件為：37 ℃、5% CO2。24 h后換完全培養(yǎng)液，此后3 d半量換液1次。為抑制非神經(jīng)元細胞的生長，接種第4天起加入5 μmol/L的阿糖胞苷，獲得較為純凈的神經(jīng)元細胞。

1.2.2 PARK2 RNA干擾靶點序列的構(gòu)建依據(jù)PARK2基因序列，用軟件設計(上海吉滿生物科技公司)了4個RNA干擾靶點序列(見表1)。依據(jù)表1序列構(gòu)建4對shRNA慢病毒重組質(zhì)粒，最后轉(zhuǎn)染氯化鈣處理的感受態(tài)紋狀體神經(jīng)元細胞。

表1 4個RNA干擾靶點序列

編號干擾靶點序列(靶點)GC(%)1GCATACCGGGTGGATCAAAGA522GCTCAACGATCGGCAGTTTGT523GCTGGGATGATGTCTTAATTC434GGAACAACAGAGTATCGTTCA43

1.2.3PARK2干擾靶點篩選 將大鼠紋狀體神經(jīng)元細胞接種于培養(yǎng)板中[實驗細胞分為2組，即空載組(NC-shRNA，使用僅含有慢病毒的稀釋液)和處理組(使用含有PARK2shRNA慢病毒稀釋液)]，從超低溫冰箱取出病毒原液經(jīng)冰浴融化稀釋后分別加入2個處理組中。用實時熒光定量PCR檢測大鼠紋狀體神經(jīng)細胞中PARK2的表達水平。使用的PARK2和β-acting的引物序列見表2。

1.2.4 實時熒光定量PCR方法 提取細胞RNA，每個培養(yǎng)細胞孔加入1 mL Trizol液，用槍頭吹吸混勻，盡量讓細胞全部裂解吸入EP管中，室溫放置5 min。每管中各加入0.2 mL氯仿，反復顛倒混勻15 s，冰上孵育15 min，12 000 rpm 4 ℃離心10 min，分離RNA；取上層水相于一新的離心管中，每管中各加0.5 mL異丙醇，混勻置于冰上孵育20 min，12 000 rpm，4 ℃離心10 min。75%的酒精洗滌沉淀，RNA溶于50～100 μL DEPC水中并測定RNA的濃度(OD260/OD280值在1.8～2.0視為純度符合要求)。

逆轉(zhuǎn)錄反應體系：RNA 2 μL，5×VILOReaction Mix 4 μL，10×Super Script Enzyme Mix 2 μL，DEPC-treated water 12 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：25 ℃，10 min；42 ℃，60 min；85 ℃，5 min終止反應)。實時熒光定量PCR反應體系：2×SYBR Mix，7.5μL，上游引物(10 μmol/L)0.15 μL，下游引物(10 μmol/L)0.15 μL，模板1.5 μL，超純水5.7 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：95 ℃預變性10 min，然后95 ℃，15 s及60 ℃，60 s共40個循環(huán))。

將設計的4個干擾序列分別對原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞進行PARK2敲低(實驗分為：空白組、空載組及S1、S2、S3、S4共6個組)，根據(jù)對mRNA的敲低效果，選出1個敲低效果最好的干擾序列，進行后續(xù)神經(jīng)元細胞染錳后錳對PARK2影響的效果研究。

表2PARK2和β-actin引物序列

基因名稱順向引物反向引物PARK2CACGACGCTCAACTTGGCTACTGCACTCCTCGGCACCATACTβ-actinATGATTCTACCCACGGCAAGCTGGAAGATGGTGATGGGTT

1.2.5 實驗分組 將原代培養(yǎng)神經(jīng)元細胞分為2個實驗組，分別感染空載慢病毒及 PARK2shRNA慢病毒。在兩組實驗細胞中，分別進行不同錳濃度處理，根據(jù)我們前期的研究結(jié)果設計錳染毒濃度：對照組(錳濃度為0)和3個染錳濃度組(低、中、高濃度分別為100、300和500 μmol/L)，處理時間均為24 h。然后檢測PARK2 mRNA及其表達產(chǎn)物Parkin。

Western blot方法：細胞用PBS洗滌3次后加入適量的預冷1×Lysis Buffer，刮下細胞轉(zhuǎn)移入1.5 mL Ep管中，4 ℃，12 000 rpm，離心15 min。加入裂解液，反復吹吸至充分裂解后再超聲勻漿器勻漿30 s；4 ℃，12 000 rpm，離心15 min。封口-80 ℃保存?zhèn)溆?。將每個樣品蛋白的終濃度調(diào)整為2 μg/μL，并將每個樣品取出相同總蛋白量，加入4× loading buffer上樣緩沖液搖勻后，放入沸水浴煮10 min，最后放入4 ℃存放備用。制備10%分離膠后上樣，先用80 V電壓使溴酚藍跑至分離膠線后，轉(zhuǎn)換電壓至120 V電泳。電泳完成后轉(zhuǎn)膜，300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜120 min轉(zhuǎn)到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜放入TBST(TBS+0.1%吐溫)液中清洗10 min。將PVDF膜放入封閉液(5%脫脂牛奶的TBST溶液)中，室溫封閉2 h。使用TBST液洗膜3次，每次10 min。加入一抗(一抗用含5% BSA的TBST液稀釋)4 ℃孵育并過夜。次日孵育一抗結(jié)束后，使用TBST液洗膜3次，每次10 min。加入二抗(二抗用含5%脫脂牛奶的TBST液稀釋)后室溫反應2 h，用TBST溶液洗膜5次，每次8 min。采用ECL發(fā)光液進行顯色。

2 結(jié)果

2.1 篩選PARK2基因干擾序列

2.1.1 實時熒光定量PCR檢測干擾效果 實驗結(jié)果顯示，針對所設計的4個PARK2干擾靶點(S1、S2、S3和S4)進行敲低后與空白組和空載組比較，PARK2的表達(mRNA)均明顯下降，降低水平均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中以S4靶點降低最多；空白組與空載組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

組別PARK2mRNA相對水平Parkin蛋白相對水平空白組116±028063±029空載組100±030058±025S1074±022?039±011?S2040±019?029±020?S3023±020?025±017?S4019±016?021±015?

*：P<0.01；空白組與空載組比較，P>0.05。

2.1.2 Western Blot檢測對PARK2表達蛋白Parkin的干擾效果 實驗結(jié)果顯示，S1、S2、S3和S4與空白組和空載組比較，PARK2shRNA處理組PARK2表達產(chǎn)物Parkin均明顯下降(P<0.01)，其中以S4的干擾效果最好?？瞻捉M和空載組之間比較，其差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3，圖1)。

根據(jù)4個設計的PARK2基因干擾靶點的干擾效果，我們選取S4作為下一步觀察研究錳與PARK2之間相互關(guān)系的干擾序列。

Ctrl：空白組；NC：空載組；S1～S4：PARK2sh RNA1～4處理組。 圖1 Western Blot驗證大鼠紋狀體神經(jīng)細胞中PARK2shRNA的敲低效果

2.2 不同錳濃度染毒后對PARK2基因的影響

2.2.1 空載慢病毒感染神經(jīng)細胞后染錳對PARK2基因mRNA及蛋白表達的影響 以空載慢病毒感染的紋狀體神經(jīng)元細胞作為受試對象，染錳24 h后，實時熒光定量PCR檢測PARK2 mRNA水平結(jié)果：100 μmol/L劑量組表達雖有下降，但不具有統(tǒng)計學意義。然而，隨著染毒劑量增加，PARK2基因表達進一步下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表4)。

同樣，染不同劑量錳24 h后，Western-blot對Parkin蛋白的檢測結(jié)果顯示，100 μmol/L劑量組Parkin下降，但差異不具有統(tǒng)計學意義。當染錳劑量增加至300和500 μmol/L時，表達下降所出現(xiàn)的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表4，圖2A)。

組別錳濃度(μmol/L)PARK2mRNA相對水平Parkin蛋白相對水平對照組0100±019124±018低錳濃度組100081±015110±023中錳濃度組300047±009??082±015??高錳濃度組500020±005??062±020??

**：與對照比較，P<0.01。

0、100、300和500分別表示錳濃度為0、100、300和500 μmol/L的分組。圖2 空載慢病毒組(A)和慢病毒RNAi組(B)不同濃度錳暴露24 h對Parkin蛋白的影響

2.2.2 慢病毒RNAi感染神經(jīng)細胞后染錳對PARK2基因mRNA表達及蛋白水平的影響 以紋狀體神經(jīng)元細胞感染慢病毒RNAi載體后作為受試對象再染錳，24 h后實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，染錳不同劑量對PARK2 mRNA的表達均有影響，而且隨著染錳劑量的增加，該基因mRNA表達進一步下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，見表5)。同樣染錳24 h后，Western-blot對PARK2表達產(chǎn)物Parkin蛋白的檢測結(jié)果顯示，隨著染毒劑量的增加，其Parkin蛋白水平逐步降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05，見表5，圖2B)。

組別錳濃度(μmol/L)PARK2mRNA相對水平Parkin蛋白相對水平對照組0044±008042±009低錳濃度組100022±013??028±005?中錳濃度組300019±005??024±004??高錳濃度組500013±002??019±007??

與對照比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

本研究使用慢病毒[6]作為載體，根據(jù)PARK2的基因序列設計了4個干擾序列，針對PARK2基因的4個RNAi靶點，在體外構(gòu)建能夠在細胞中敲低PARK2基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染紋狀體神經(jīng)細胞后進行染錳研究，經(jīng)實驗驗證選取了一個對PARK2基因敲低效果較好的序列用于后期研究。所選取的序列能夠在細胞中穩(wěn)定表達，長期抑制目標基因，效果穩(wěn)定。

錳在多種行業(yè)和日常生活中均有較廣泛的應用，導致職業(yè)環(huán)境和生活環(huán)境中錳的濃度均有增高趨勢。因此，不管是職業(yè)接觸人群，還是普通生活環(huán)境中的人群均有可能在體內(nèi)蓄積錳，產(chǎn)生錳中毒危險。錳在體內(nèi)主要蓄積于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過核磁共振對錳接觸人群的檢測顯示，錳主要在大腦黑質(zhì)、紋狀體蓄積[7]。我們的前期研究結(jié)果顯示，錳可對DA能神經(jīng)元產(chǎn)生損害。雖然錳中毒與帕金森病兩者發(fā)病機制不同，但都屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損，主要影響的神經(jīng)細胞都為多巴胺神經(jīng)元細胞。

在本研究中，通過觀察神經(jīng)元細胞經(jīng)RNA干擾后染錳對PARK2基因的mRNA和蛋白水平的變化，探討PARK2在錳所致神經(jīng)毒性危害中的作用機制。研究結(jié)果證實，紋狀體神經(jīng)細胞感染慢病毒PARK2shRNA后染錳比感染空載慢病毒后染錳的PARK2基因表達無論在mRNA水平還是其表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)Parkin水平均產(chǎn)生更為明顯的降低趨勢。研究結(jié)果證實對PARK2基因的有效RNA干擾加重了錳對PARK2表達的抑制作用。錳對多巴胺神經(jīng)細胞的毒性效應可能涉及多種機制，其中，增加細胞過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生、對線粒體功能的損傷、影響細胞內(nèi)錯誤蛋白的清除均可能是重要的作用機制。影響PARK2的表達直接影響到細胞內(nèi)折疊錯誤蛋白的清除過程，導致細胞功能下降和細胞死亡[8-10]，該研究結(jié)果與我們的團隊成員邱靜等[11]和張艷淑等[12]前期用PC12細胞和大鼠的研究結(jié)果一致。進一步說明PARK2基因的表達產(chǎn)物Parkin在錳所引起的神經(jīng)毒性效應中起著重要作用，該過程可能與錳引起神經(jīng)毒性機制有關(guān)，值得進一步研究。

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收稿2016-10-08;修回2016-11-19〗

(編輯：王靜)

Effects of manganese on PARK2 expression in rat striatal neurons

TaoDong1,DengYan2,ZhangBei3,LuoYing1,FanQiyuan4

(1.Department of Toxicology,School of Public Health,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of General Medicine,The First People’s Hospital of Bijie,Bijie Guizhou 551700,China; 3.Department of Osteology,The First Hospital of Zunyi City,Zunyi Guizhou 563000,China; 4.Department of Health Administrative,Zunyi Medical and Pharmaceutical College,Zunyi Guizhou 563000,China)

Objective To explore the effects of manganese (Mn) onPARK2 expression in rat striatal neurons with/without the RNA interference.Methods After treatment with a serials of manganese concentration(0,100，300，500 μmol/l)for 24 h,the PARK2 mRNA and protein (Parkin) levels,in the rat striatal neurons (transfected with lentivirus or with lentivirus PARK2 shRNA),were measured by real-time PCR and western blot,separately.Results Compared with the control group,the levels of PARK2 mRNA and Parkin decreased significantly (P<0.01) in the striatal neurons transfected with lentivirus after exposure to 300 and 500 μmol/l of Mn for 24 h,while the decreases were more significant (P< 0.05,P<0.01)in striatal neurons (transfected with lentiviral PARK2 shRNA) after exposure to 100,300 and 500 μmol/l of Mn for 24 h.Conclusion The striatal neurons transfected with lentiviral PARK2 shRNA expressed lower levels of PARK2 mRNA and Parkin protein after exposure to Mn for 24 h,indicating that Mn suppresses PARK2 expression as a mechanism of its toxicity to neurons.

manganese; neuron; PARK2; shRNA

國家自然科學基金資助項目(NO：81260420)；貴州省科技廳資助項目(NO：SY2012〗3140)；遵義醫(yī)學院基礎藥理省部共建實驗室開放課題(NO：2014-2)。

范奇元，男，博士，教授，碩士生導師，研究方向：金屬毒理學，E-mail:1719975989@qq.com。

R135

A

1000-2715(2016)06-0588-05