惠 景，李曉飛，朱欣婷，姜?jiǎng)倌?，?容，范 芳，劉 云

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

3種斑蝥素堿土金屬鹽類衍生物對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

惠 景1,2，李曉飛1,2，朱欣婷1,2，姜?jiǎng)倌?，晏 容1,2，范 芳1,2，劉 云1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省普通高等學(xué)校特色藥物腫瘤防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化教研室，貴州 遵義 563099)

目的 比較3種斑蝥素堿土金屬鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制增殖及促凋亡作用。方法 采用3種斑蝥素鹽類衍生物分別對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞HepG2進(jìn)行干預(yù)，磺酰羅丹明染色法(SRB 法)檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制作用；相差顯微鏡結(jié)合Hoechst33342染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果 3種斑蝥素鹽類衍生物均呈濃度依賴性抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)，尤以斑蝥素酸鎂的抑制效應(yīng)最強(qiáng)(P<0.05)；斑蝥素酸鎂對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的形態(tài)影響比斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶明顯；Hoechst 33342染色顯示斑蝥素酸鎂致HepG2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡細(xì)胞形態(tài)特征比斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶明顯；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，同一濃度3 μg/mL的斑蝥素酸鎂的促進(jìn)凋亡作用明顯高于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。結(jié)論 3種斑蝥素鹽類衍生物均具有抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸鎂的作用明顯強(qiáng)于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶。

斑蝥素酸鎂；斑蝥素酸鈣；斑蝥素酸鍶；人肝癌細(xì)胞HepG2；抗腫瘤

斑蝥素(Cantharidin)是芫菁科昆蟲體內(nèi)產(chǎn)生的活性物質(zhì)，研究表明它能夠治療多種癌癥，包括肝癌、乳腺癌、食管癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等[1-3]。本課題組前期研究也表明斑蝥素類物質(zhì)能通過(guò)干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期的變化，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的[4]。作為臨床化療藥物，其最大優(yōu)點(diǎn)是不會(huì)降低癌癥患者體內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)量水平，對(duì)于肝癌的治療效果最為明顯[5]。但是，斑蝥素會(huì)對(duì)泌尿系統(tǒng)和腎臟帶來(lái)毒副作用。因此，目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)是：開發(fā)一系列具有抑癌作用的 斑蝥素衍生物，使其在保留治療效果的同時(shí)，能最大限度的降低生物毒性[6-7]。

本課題組前期工作以斑蝥素為原料合成了多種斑蝥素鹽類衍生物，包括斑蝥素酸鈉、斑蝥素酸鎂和斑蝥素酸鉀等，并對(duì)其抗癌活性做了報(bào)道[8-9]；研究發(fā)現(xiàn)鎂元素與斑蝥素相結(jié)合后，能顯著提升斑蝥素的活性，改善其水溶性。鎂元素為第二主族第三周期的元素，在這個(gè)主族中，鎂(Mg)和鈣(Ca)都是人類所需礦物質(zhì)的常量元素，在作為酶的激活劑和保持神經(jīng)肌肉興奮性等方面具有重要作用，是維持生命代謝不可替代的重要元素[10-12]。該主族的鍶(Si)元素作為人體所需的微量元素能防止腦血栓形成[13]和骨質(zhì)的流失[14]。而在第二主族元素中鈹、鋇、鐳的攝取會(huì)對(duì)人體造成傷害。因此，本研究選擇合成了斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶3種斑蝥素的鹽類衍生物，擬考察與鎂元素處于同一主族的其它金屬元素(如鈣、鍶)與斑蝥素結(jié)合后的抗癌活性差異，為進(jìn)一步評(píng)價(jià)此類衍生物的不同抗癌應(yīng)用前景奠定實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 斑蝥素酸鎂由自制斑蝥素合成，制備方法已授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利[15]，斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鍶的合成方法參考斑蝥素酸鎂完成。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前，先用去離子水將上述3種衍生物分別配置成1.2 mg/mL的母液備用。

1.1.2 肝癌細(xì)胞株 人肝癌細(xì)胞HepG2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3 試劑 磺酰羅丹明(SRB)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、南美胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)HYCLONE公司；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst33342染液為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 3131型CO2培養(yǎng)箱和Multiskanspectrum全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；NikonYS100顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細(xì)胞的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的南美胎牛血清)在37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度至80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗2～3遍，用0.25%胰蛋白酶消化后，加培養(yǎng)液吹打均勻，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。本研究共分為4個(gè)組：分別為對(duì)照組，斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣、斑蝥素酸鍶干預(yù)組，給藥方式為將藥物配置成對(duì)應(yīng)濃度的母液再直接混合到培養(yǎng)基中。

1.2.3 人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)變化 接種100 μL細(xì)胞于96孔板中(8 000 個(gè)細(xì)胞)，37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)20 h后，再加入斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶，終濃度為3 μg/mL，對(duì)照組加100 μL培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h后，通過(guò)普通光學(xué)顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)變化。然后PBS洗1遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，棄固定液，PBS洗1遍，加Hoechst 33342染色液100 μL避光染色25 min，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征。

1.2.4 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 接種1 mL細(xì)胞于6孔板中(2×105個(gè)細(xì)胞)，37 ℃、5% CO2和60%的濕度下培養(yǎng)20 h后，加入斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶，藥物終濃度均為3 μg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組。將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用 由圖1可知，3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖都具有抑制作用。在給藥24 h后，其受試物在濃度0.375～6.000 μg/mL范圍內(nèi)抑制作用隨濃度增加而增加，量效關(guān)系明顯。其中斑蝥素酸鎂的抑制肝癌細(xì)胞的活性明顯好于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。

A：作用時(shí)間24 h；B：作用時(shí)間48 h；C：作用時(shí)間72 h。圖1 3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2增殖的抑制作用

2.2 3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響 如圖2所示，3 μg/mL的斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細(xì)胞HepG2 48 h后，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞皺縮變圓，而相同濃度的斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶的抑制效果明顯不如斑蝥素酸鎂。經(jīng)Hoechst 33342染色后，3 μg/mL斑蝥素酸鎂作用于人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞24 h后，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核固縮、致密濃染呈藍(lán)色，而相同濃度的斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的作用效果明顯弱于斑蝥素酸鎂。

A:空白對(duì)照組；B:斑蝥素酸鎂；C：斑蝥素酸鈣；D:斑蝥素酸鍶。A1、B1、C1、D1為相差顯微鏡所見；A2、B2、C2、D2為Hoechst33342染色結(jié)果。圖2 3種斑蝥素衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2形態(tài)的影響

2.3 3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的促凋亡作用 終濃度為3 μg/mL的斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶分別作用于人肝癌細(xì)胞HepG2 24 h后，流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖檢測(cè)顯示早期凋亡細(xì)胞的存在(見圖3)，其中斑蝥素酸鎂促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞發(fā)生早期凋亡的能力明顯強(qiáng)于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶(P<0.05)。

A:空白對(duì)照組；B:斑蝥素酸鎂；C：斑蝥素酸鈣；D:斑蝥素酸鍶。n=3,*：P<0.05。圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3種斑蝥素鹽類衍生物對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的促凋亡作用

3 討論

斑蝥素是從我國(guó)珍貴傳統(tǒng)中藥斑蝥中提取的并已確定結(jié)構(gòu)的抗癌藥物，其具有良好的廣譜抗腫瘤活性。目前，國(guó)內(nèi)外研究人員通過(guò)改造斑蝥素結(jié)構(gòu)，合成衍生物，研究其抗癌活性及機(jī)理。還有研究人員將斑蝥素與其它化療藥物或靶向物質(zhì)聯(lián)用，尋求更好的治療癌癥效果[16-19]。這些都說(shuō)明斑蝥素具有極強(qiáng)的改造潛力、研究?jī)r(jià)值和發(fā)展前景[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，3種斑蝥素鹽類衍生物均具有抑制人肝癌細(xì)胞HepG2增殖并促其凋亡的作用，但斑蝥素酸鎂的作用明顯強(qiáng)于斑蝥素酸鈣和斑蝥素酸鍶。從上述結(jié)果可以看出隨著第二主族中原子半徑的增加，斑蝥素相關(guān)鹽類衍生物的抗腫瘤活性在降低。雖然鎂、鈣、鍶都屬于第二主族元素，但是就個(gè)體屬性而言，鎂元素的堿土性質(zhì)明顯低于鈣元素和鍶元素。此外，鎂離子還是細(xì)胞中多種酶的輔助因子和激活劑，參與細(xì)胞分裂、生長(zhǎng)、凋亡，在整個(gè)細(xì)胞周期中起著非常重要的作用。國(guó)內(nèi)外研究人員發(fā)現(xiàn)攝入一定量的鎂元素能降低化療帶來(lái)的副作用[22]，并且鎂元素的攝入與腫瘤發(fā)生率之間呈現(xiàn)某種相關(guān)性[23]：比如長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤調(diào)查顯示鎂元素的攝取會(huì)有利于初期胰腺癌的抑制[24]。通過(guò)對(duì)癌癥患者體內(nèi)微量元素的檢測(cè)也證實(shí)正常人與患者體內(nèi)鎂元素含量有顯著差異[25]：子宮肌瘤組織中的鎂元素明顯低于正常組織。這些研究表明鎂元素與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有某種潛在的關(guān)系，在斑蝥素的結(jié)構(gòu)上引入鎂元素后表現(xiàn)出的良好抗癌活性，有可能是斑蝥素和鎂元素在抗癌方面的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行了疊加。另外，三種斑蝥素鹽類衍生物的毒性還未評(píng)價(jià)，這些研究將后續(xù)跟進(jìn)。課題組希望通過(guò)本研究，能為抗癌藥物研究工作者在合成其他抗腫瘤鹽類衍生物的時(shí)候，提供一點(diǎn)提示。

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收稿2016-10-02;修回2016-11-07〗

(編輯：王靜)

The inhibitory effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on HepG2 Cells

HuiJing1,2,LiXiaofei1,2,ZhuXinting1,2,JiangShengnan1,2,YanRong1,2,FanFang1,2,LiuYun1

(1.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Biochemistry,Basic Medical College,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To test and compare the effects of three alkaline earth metal cantharidate derivatives on inhibiting proliferation and promoting apoptosis in hepatocellular carcinoma HepG2 cells.Methods Three cantharidate derivatives were added to HepG2 cells and cell growth inhibition was measured by the sulforhodamine B (SRB) assay.Morphological changes were observed through phase contrast microscope with Hoechst 33342 staining.Flow cytometry (FCM) was used to measure apoptosis of HepG2 cells.Results All the cantharidate derivatives could inhibit the proliferation of HepG2 cells concentration-dependently and magnesium cantharidate was the best(P<0.05).Magnesium cantharidate had the greatest influence on morphological changes of HepG2 cells among three derivatives.Hoechst 33342 staining indicated that the morphological changes caused by apoptosis of HepG2 cells was most obvious with magnesium cantharidate among three derivatives.Magnesium cantharidate had the greatest influence on promoting apoptosis of HepG2 cells among three cantharidate derivatives with the same concentration (3 μg/ml) (P<0.05).Conclusion All three cantharidate derivatives could inhibit the proliferation and promote the apoptosis of HepG2 cells in vitro.In terms of the effects,magnesium cantharidate was the best.

magnesium cantharidate；calcium cantharidate；strontium cantharidate；hepatocellular carcinoma cells HepG2；anti-tumor

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81560669，81260488)；貴州省科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(NO：黔科合LH字20157509，黔科合LH字2015〗7516)；貴州省衛(wèi)計(jì)委科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：gzwjk2015-1-013)；貴州省教育廳特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(NO：黔教合KY字2014〗212)。

劉云，男，博士，副教授，研究方向：小分子抗癌藥物研究與開發(fā)，E-mail:liuyunzy@126.com。

R739.65

A

1000-2715(2016)06-0568-05