朱桂松，傅元冬，陳暢泉

(江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

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川黃合劑對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞IL-6和IL-8表達(dá)的影響

朱桂松，傅元冬，陳暢泉

(江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001)

[摘要]目的探討川黃合劑對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)增殖及白細(xì)胞介素-6(IL-6)和IL-8表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)HPMCs，用含1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液同步24 h后，分為空白對(duì)照組、TNF-α誘導(dǎo)組(1 μg/L)和低、中、高劑量川黃合劑干預(yù)組(n=3)。采用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量，細(xì)胞沉淀用BCA蛋白檢測(cè)方法測(cè)定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量，用以校正ELISA結(jié)果。結(jié)果干預(yù)48 h后，3種濃度川黃合劑干預(yù)組的OD值、PI值均顯著高于TNF-α誘導(dǎo)組(P均<0.05)，且IL-6和IL-8蛋白表達(dá)水平均明顯低于TNF-α誘導(dǎo)組 (P均<0.05)。結(jié)論川黃合劑能增強(qiáng)炎癥狀態(tài)下HPMCs活性，并降低炎癥因子IL-6和IL-8的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]川黃合劑；生大黃；川芎；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-8；急性腹膜炎

急性腹膜炎是臨床常見急腹癥，治療不及時(shí)易引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)/膿毒血癥(SEPSIS)并導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)或多臟器衰竭(MOF)，病死率極高[1]。多種炎癥因子參與腹膜炎的病理生理過程，其中最主要的促炎因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和某些白細(xì)胞介素家族成員如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、IL-8，這些炎癥遞質(zhì)在體內(nèi)組成復(fù)雜龐大的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，在炎癥反應(yīng)時(shí)形成“瀑布式”釋放的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)SIRS及MODS[2-3]。因此，治療腹膜炎的核心就是早期抑制炎癥因子的表達(dá)，阻斷失控的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞損害。根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則，我院自擬川黃合劑(大黃和川芎配伍)治療腹膜炎取得了很好的臨床療效。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察川黃合劑對(duì)體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞(HPMCs)在急性炎癥狀態(tài)下炎癥因子的干預(yù)作用，探討川黃合劑的抗炎效應(yīng)以及對(duì)HPMCs的保護(hù)作用，為臨床應(yīng)用川黃合劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1材料生大黃顆粒劑(1包相當(dāng)于生藥10 g)，川芎(1包相當(dāng)于生藥6 g)，由江陰天江藥業(yè)有限公司提供；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FCS)、RPMI-1640粉劑等(Gibco公司)；胰蛋白酶(Promega公司)；IL-6、IL-8和ELISA試劑盒(ADL公司)；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技公司)；抗細(xì)胞角蛋白抗體、抗細(xì)胞波形蛋白抗體、第Ⅷ因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體(北京中山生物技術(shù)有限公司)；NU-2500E 二氧化碳培養(yǎng)箱(Nuaire)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Biobank)。

1.2方法

1.2.1HPMCs的培養(yǎng)與鑒定取南京市中醫(yī)院普外科及肛腸科30例(排除腹膜炎)擇期腹部手術(shù)患者捐獻(xiàn)的大網(wǎng)膜組織，按標(biāo)準(zhǔn)方法原代培養(yǎng)HPMCs，按1∶3傳代，第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。倒置相差顯微鏡觀察HPMCs呈多邊形，似鋪路鵝卵石樣外觀；免疫組化鑒定抗細(xì)胞角蛋白抗體和抗波形蛋白抗體染色陽性、抗第Ⅷ因子抗體和抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性。

1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟和分組生大黃顆粒、川芎顆粒各1包紫外線消毒，分別用滅菌注射用水60 mL溶解，備用。HPMCs用含1%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液同步24 h后分為5組(每組設(shè)3個(gè)樣本)，即空白對(duì)照組、TNF-α誘導(dǎo)組(1 μg/L)和TNF-α誘導(dǎo)加低、中、高劑量川黃合劑(生大黃終濃度分別為10，30，60 mg/L；川芎濃度分別為6，18，36 mg/L)干預(yù)組。各組完全培養(yǎng)液均為含有15%FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液。細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.2.3細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)川黃合劑中生大黃與川芎配伍比率選為10∶6，為了排除本實(shí)驗(yàn)中所選擇的生大黃與川芎濃度對(duì)HPMCs本身產(chǎn)生毒性作用，對(duì)實(shí)驗(yàn)濃度的川黃合劑進(jìn)行了細(xì)胞毒性的觀察。步驟如下：用完全培養(yǎng)液將HPMCs以105個(gè)/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后再每孔加入生大黃終濃度分別為10，30，60 mg/L和川芎濃度分別為6，18，36 mg/L的川黃合劑，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4活細(xì)胞數(shù)測(cè)定分組干預(yù)48 h后，吸棄舊培養(yǎng)液，加入MTT(5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加DMSO振蕩混勻，置于自動(dòng)酶標(biāo)儀上，自動(dòng)酶標(biāo)儀以490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度(OD)值，以O(shè)D 值表示HPMCs活性。

1.2.5細(xì)胞增殖情況檢測(cè)取干預(yù)48 h后的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，每孔加入0.5 mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；碘化丙啶室溫避光染色20 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況，Cell Quest軟件分析，用細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(proliferation index,PI)表示相對(duì)增殖活力。計(jì)算公式為：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2M) ×100%。

1.2.6細(xì)胞上清液中IL-6和IL-8蛋白含量檢測(cè)離心取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-6和IL-8蛋白含量。用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶解細(xì)胞沉淀，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞沉淀中蛋白質(zhì)濃度，用相應(yīng)蛋白質(zhì)濃度結(jié)果校正檢測(cè)結(jié)果。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)所選劑量的川黃合劑無明顯毒性作用，細(xì)胞形態(tài)良好。

2.2各組HPMCs活性空白對(duì)照組MTT OD值為0.89±0.06，TNF-α誘導(dǎo)組為0.48±0.04，低劑量川黃合劑組為0.59±0.03，中劑量川黃合劑組為0.64±0.05，高劑量川黃合劑組為0.69±0.06。TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞MTT OD值明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)；加用川黃合劑干預(yù)后， MTT OD值均顯著高于TNF-α誘導(dǎo)組(P均<0.05)。

2.3各組細(xì)胞增殖情況空白對(duì)照組HPMCs PI值為19.47±2.05，TNF-α誘導(dǎo)組為10.70±1.61，低劑量川黃合劑組為14.94±1.69，中劑量川黃合劑組為15.16±1.82，高劑量川黃合劑組為16.63±2.12。TNF-α誘導(dǎo)組PI值明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)；加用川黃合劑干預(yù)后，PI值均顯著高于TNF-α誘導(dǎo)組(P均<0.05)。

2.4各組上清液中IL-6和IL-8蛋白含量TNF-α誘導(dǎo)組上清液中IL-6和IL-8含量均明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)；加用川黃合劑干預(yù)后，上清液中IL-6和IL-8含量均明顯低于TNF-α誘導(dǎo)組(P均<0.05)。見表1。

表1　各組上清液中IL-6和IL-8蛋白含量

注：①與空白對(duì)照組比較，P<0.05；②與TNF-α誘導(dǎo)組比較，P<0.05。

3討論

急性腹膜炎可以是原發(fā)或繼發(fā)起病，如消化道穿孔、膽管穿孔、腹腔內(nèi)器官損傷破裂或血運(yùn)障礙壞死、重癥感染致腸道菌群移位等[4-5]。細(xì)菌和內(nèi)毒素等抗原激活宿主單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，后者釋放多種細(xì)胞因子，引起促炎和抗炎反應(yīng)失衡，持續(xù)不受控制的炎癥反應(yīng)即SIRS[2，6]。所以說，炎癥因子在腹膜炎的病理生理過程中占主導(dǎo)地位。目前認(rèn)為TNF-α是炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)因子[7-8]，而HPMCs作為腹膜表面的主要細(xì)胞層參與了炎癥反應(yīng)過程[9]。近年來連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)等搶救技術(shù)有較大發(fā)展，但腹膜炎引起的SEPSIS及MODS的病死率仍然居高不下，這就使得臨床醫(yī)生不斷探索有效的聯(lián)合治療方法。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)注重整體觀念，強(qiáng)調(diào)陰陽平衡，雙向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫及器官功能狀態(tài)，在早期抑制炎癥反應(yīng)、防治MODS、降低臨床病死率方面有積極意義[6]。在古代文獻(xiàn)中有類似急性腹膜炎癥候的記載，散見于“腸癰”“腹痛”“厥心痛”“厥逆”“結(jié)胸”“脾心痛”“腸結(jié)腹痛”“心腹痛”等的論述中。如《素問·至真要大論》記載：“厥陰之腹，少腹堅(jiān)滿，里急暴痛……厥心痛，汗發(fā)嘔吐?！薄秱摗酚涊d“心下痛，按之石硬”、“從心下至少腹硬滿而痛，不可近”?！毒霸廊珪な冀?jīng)篇》云：“厥逆之為病也，足暴青，胸若將裂，腸若將以刀切之，煩而不能食?！边@些描述與急性腹膜炎的癥狀相似，提示在急性腹膜炎的某階段，可參照其中的理法方藥進(jìn)行辨治。

急性腹膜炎中醫(yī)辨證多為陽明證或少陽陽明合病，病位在腑，常表現(xiàn)出腹?jié)M拒按、便結(jié)或便閉等熱結(jié)陰陽、腑實(shí)不通之證。根據(jù)中醫(yī)“腑通以通為補(bǔ)，六腑以通為用”的原則，治療以清熱解毒、通里攻下為主，活血化瘀、理氣開郁為輔。通腑攻下具有泄熱、行瘀、通便的作用，可促進(jìn)腸蠕動(dòng)，改善腹腔及臟器的血液循環(huán)，促進(jìn)炎癥的局限和吸收，同時(shí)減少了內(nèi)毒素異位，從而顯著減輕腸源性內(nèi)毒素血癥造成的臟器損傷[10]。川黃合劑取大黃和川芎配伍，能“通里攻下、清瘀熱、解熱毒”，同時(shí)“氣行則血行”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大黃有改善微循環(huán)、抑酶、抑菌、抑制巨噬細(xì)胞過度激活及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，減少炎癥細(xì)胞因子及自由基的釋放等作用[11]。大黃還可抑制炎癥因子表達(dá)；增加腸蠕動(dòng)，減少腸道對(duì)葡萄糖、鈉、水的吸收稀釋和排泄細(xì)菌和毒素；保護(hù)腸道黏膜屏障，阻止腸道細(xì)菌易位和內(nèi)毒素血癥的發(fā)生；抑制腸道細(xì)菌生長(zhǎng)，達(dá)到清理腸道的作用；腸外器官保護(hù)作用。川芎具有改善微循環(huán)的作用，并且可以提高其他藥物的抗炎作用[12]。李繼承等[13]研究發(fā)現(xiàn)中藥川芎的主要藥理成分川芎嗪具有明顯的抗菌和促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬功能的作用。賈米山等[14]用川芎嗪治療結(jié)核性腹膜炎，結(jié)果顯示可使腹水滲出減少，促進(jìn)腹水吸收，使腸粘連迅速緩解，明顯控制患者結(jié)核中毒癥狀，縮短病程。

本研究結(jié)果顯示，TNF-α能顯著上調(diào)HPMCs IL-6和IL-8的表達(dá)，且抑制細(xì)胞活性，而川黃合劑能顯著對(duì)抗TNF-α的上述作用，提示川黃合劑確有抑制炎癥因子IL-6和IL-8表達(dá)、保護(hù)腹膜細(xì)胞的作用。

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Effect of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in human peritoneal mesothelial cells in vitro

ZHU Guisong, FU Yuandong, CHEN Changquan

(Nanjing Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine,Nanjing 210001,Jiangsu,China)

Abstract:Objective It is to investigate the effects of Chuan-huang mixtures on TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions and proliferation in human peritoneal mesothelial cells (HPMCs) in vitro. Methods Cell lines of HPMCs were subcultured and all experiments were performed using the cells at the third passage. After synchronization of cells growth with RPMI-1640 culture solution containing 1% fetal bovine serum, HPMCs were divided into blank control group, TNF-α-induced (1 μg/L) group and TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups. The proliferation of HPMCs was measured by MTT and flow cytometry assay. Proteins of IL-6 and IL-8 in culture supernatants were measured by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Cell protein concentration was measured by trace bicinchoninic acid (BCA) method to correct the ELISA assay results. Results After co-culturing by 48h, the proliferation of HPMCs in TNF-α-induced plus low-, medium-and high-dose Chuan-huang mixtures groups were significantly increased compared to TNF-α-induced group (all P<0.05). Moreover, Chuan-huang mixtures could significantly decrease TNF-α-induced IL-6 and IL-8 expressions in protein levels (all P<0.05). Conclusion Chuan-huang mixtures dose not only promote the cells proliferation, but also inhibit expressions of IL-6 and IL-8 in HPMCs cultured under inflammatory conditions.

Key words:Chuan-huang mixtures; Rhubarb; Ligustrazine; Interleukin-6; Interleukin-8; acute peritonitis

[收稿日期]2015-11-25

[中圖分類號(hào)]R-33

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)11-1169-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.11.008

[基金項(xiàng)目]南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(YKK14144)

[作者簡(jiǎn)介]朱桂松，男，主治醫(yī)師，博士，主要從事危重病的基礎(chǔ)和臨床研究。