黃　穎，趙春麗，韋永強(qiáng)

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院，廣西 南寧 530001)

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體外反搏治療對(duì)急性心肌梗死患者血漿miRNA-133水平的影響

黃穎，趙春麗，韋永強(qiáng)

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院，廣西 南寧 530001)

[摘要]目的觀察急性心肌梗死患者血漿miRNA-133(miR-133)表達(dá)情況和體外反搏治療(ECP)對(duì)其水平的影響。方法將60例急性心肌梗死經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)后患者隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組各30例，并選擇同期門(mén)診健康體檢者30例作為空白組。所有受試者均于入院時(shí)抽血，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)法檢測(cè)血漿miR-133水平。治療組和對(duì)照組給予常規(guī)冠心病二級(jí)預(yù)防藥物治療，治療組在PCI術(shù)后第3周加用ECP，1 h/(次·d)，每周5次，為期7周；2組均于治療9周后分別測(cè)定患者血漿miR-133表達(dá)水平，評(píng)估心絞痛癥狀改善情況，同時(shí)觀察超聲心動(dòng)圖心功能各項(xiàng)指標(biāo)變化情況。結(jié)果與空白組比較，治療組急性心肌梗死患者血漿miR-133表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；治療9周后，治療組血漿miR-133含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，心絞痛癥狀緩解情況及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、收縮末體積(ESV)、舒張末體積(EDV)改善情況均明顯優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.05)。結(jié)論血漿miR-133水平可作為急性心肌梗死患者發(fā)病和病情進(jìn)展的一項(xiàng)新型標(biāo)志物；ECP治療可降低急性心肌梗死患者血漿miR-133表達(dá)水平，明顯改善患者心功能。

[關(guān)鍵詞]體外反搏；miRNA-133；急性心肌梗死

急性心肌梗死是常見(jiàn)的、病死率極高的心血管疾病急重癥。體外反搏治療(ECP)由于其經(jīng)濟(jì)無(wú)創(chuàng)傷、無(wú)明顯不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于心肌梗死、動(dòng)脈粥樣硬化性等疾病的一級(jí)和二級(jí)預(yù)防[1]。miRNA是內(nèi)源性非編碼蛋白質(zhì)的單鏈調(diào)控性小RNA，與心肌肥厚、心律失常、心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。在急性心肌梗死大鼠模型和冠心病患者缺血心肌組織中已檢測(cè)到miRNA-133(miR-133)表達(dá)發(fā)生動(dòng)態(tài)改變[3]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)外周循環(huán)血中miRNA-1、miRNA-141、miRNA-210、miRNA-335等多個(gè)miRNA已成為提示腫瘤、敗血癥等病情進(jìn)展和預(yù)后的新型生物學(xué)標(biāo)志物[4]。本研究以ECP和miR-133為研究的切入點(diǎn)，選擇60例急性心肌梗死經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(PCI)術(shù)后患者作為研究對(duì)象，檢測(cè)患者入院時(shí)以及ECP治療后其血漿miR-133水平變化，以探討ECP對(duì)心肌梗死患者血漿miR-133的影響。

1臨床資料

1.1一般資料選擇2012年1月—2013年9月在本院心內(nèi)科住院行PCI術(shù)的急性心肌梗死患者60例，患者均為第1次診斷為急性心肌梗死[5]：血漿肌酸激酶水平較正常增加2倍以上或心肌肌鈣蛋白Ⅰ水平大于0.1 ng/mL；并同時(shí)具備下列至少1項(xiàng)：胸痛持續(xù)時(shí)間>20 min或動(dòng)態(tài)心電圖(ECG)診斷的變化包括新的病理性Q波、ST段和T波改變。將患者隨機(jī)分為2組：治療組30例，男16例，女14例；年齡(51.2±12.2)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)(23.3±3.2)kg/m2；TG(1.66±1.26)mmol/L；糖化血紅蛋白(HbA1c)(7.13±1.20)%；收縮壓(165.3±28.5)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。對(duì)照組30例，男15例，女15例；年齡(53.1±12.2)歲；BMI(23.6±3.3)kg/m2；TG(1.63±1.28)mmol/L；HbA1c(7.23±1.20)%；收縮壓(158.6±23.2)mmHg。同時(shí)納入同期門(mén)診健康體檢者30例作為空白組，均無(wú)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心力衰竭、心律失常和心肌病等心臟疾病病史，無(wú)惡性腫瘤及腎臟替代治療；男16例，女14例；年齡(53.3±12.3)歲；BMI(23.4±3.6)kg/m2；TG(1.56±1.29)mmol/L；HbA1c(7.23±1.22)%；收縮壓(158.2±23.2)mmHg。3組受試者年齡、BMI、血脂、HbA1c、收縮壓比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2治療方法治療組和對(duì)照組均行PCI術(shù)，術(shù)后均給予常規(guī)冠心病二級(jí)預(yù)防藥物治療，治療組在此基礎(chǔ)上于PCI術(shù)后第3周加用ECP治療，1 h/(次·d)，每周5次，為期7周。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.3檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)受試者血漿miRNA-133表達(dá)情況受試者均于入院時(shí)采集肘靜脈全血4 mL，以3.8%枸櫞酸鈉抗凝，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，收集血漿，分裝后-20 ℃凍存，實(shí)驗(yàn)前取出室溫解凍待測(cè)。治療組和對(duì)照組于治療9周后再次取血檢測(cè)。具體方法：取1 mL血漿以Trizol(Invitrogen)法提取血漿總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光度值，計(jì)算RNA濃度，瓊脂糖電泳鑒定RNA的完整性。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參照，具體引物序列及擴(kuò)增片段見(jiàn)表1。將上述PCR產(chǎn)物連接到pMDl8-T質(zhì)粒載體(Invitrogen公司)上，增菌后用質(zhì)粒提取試劑盒(上海生工公司)提取質(zhì)粒DNA，對(duì)質(zhì)粒DNA酶切鑒定后進(jìn)行序列測(cè)定(上海英駿生物技術(shù)有限公司)。將含有目的擴(kuò)增片段的質(zhì)粒DNA稀釋至1×107，1×106，1×105，1×104，1×103copies/μL，測(cè)定定量曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而得出治療組miR-133相對(duì)于對(duì)照組增加或減少的倍數(shù)。

表1　miR-133及β-actin基因PCR引物

1.3.2觀察患者心絞痛癥狀改善情況和超聲心動(dòng)圖心功能各項(xiàng)指標(biāo)變化情況治療9周后評(píng)估治療組和對(duì)照組患者心絞痛癥狀情況，并于治療第2周和治療9周后采用超聲心動(dòng)圖(Philips iE33型彩色多普勒顯像儀，二維圖像采集用S4矩陣探頭，頻率2～4 MHz)測(cè)定心功能收縮和舒張功能各項(xiàng)指標(biāo)[包括左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF),收縮末體積(ESV),舒張末體積 (EDV)]。

2結(jié)果

2.1受試者血漿miR-133表達(dá)情況入院時(shí)，治療組和對(duì)照組患者血漿miR-133表達(dá)水平均明顯高于空白組(P均<0.05)；治療9周后，治療組血漿miR-133表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　3組血漿miR-133表達(dá)情況比較

2.2患者治療后心絞痛癥狀和超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)情況比較治療9周后，治療組6例(20%)出現(xiàn)心絞痛癥狀，但持續(xù)時(shí)間明顯縮短；對(duì)照組14例(47%)出現(xiàn)心絞痛癥狀，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組超聲心動(dòng)圖各指標(biāo)改善情況均優(yōu)于對(duì)照組(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

表2　2組治療9周后超聲心動(dòng)圖結(jié)果比較±s)

注：①與治療第2周比較，P<0.05；②與對(duì)照組比較，P<0.05。

3討論

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，缺血性心臟病的治療已經(jīng)從單一的血管擴(kuò)張劑治療過(guò)渡到復(fù)雜多藥物結(jié)合和ECP、神經(jīng)刺激、經(jīng)皮激光血運(yùn)重建和基因治療等非藥物輔助治療，以及外科手術(shù)和血管介入再通等創(chuàng)傷性治療措施的綜合性治療，其中創(chuàng)傷性治療僅在某個(gè)環(huán)節(jié)或終末階段對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程發(fā)揮有限的干預(yù)作用，但醫(yī)療資源消耗十分龐大[1]。近年來(lái)研究證實(shí)，ECP利用循環(huán)機(jī)械輔助裝置在心臟舒張期壓迫肢體，產(chǎn)生的雙脈動(dòng)血流可加速動(dòng)脈系統(tǒng)的血液流動(dòng)，提高主動(dòng)脈舒張壓和血流切應(yīng)力，從而增加冠脈灌流量，并調(diào)控與血管內(nèi)膜保護(hù)有關(guān)的細(xì)胞因子，是一項(xiàng)無(wú)創(chuàng)、安全有效和經(jīng)濟(jì)的心腦血管病輔助治療方法[6]。錢(qián)孝賢等[7]發(fā)現(xiàn)，ECP對(duì)心肌梗死犬的NO系統(tǒng)有影響；伍貴富等[8]也證實(shí)長(zhǎng)期ECP能促進(jìn)側(cè)支循環(huán)的形成并最終發(fā)育成熟，使心肌的結(jié)構(gòu)和功能獲得保護(hù)。

miR-133主要分布在心肌和骨骼肌，在其他組織中極少存在[9]。Wang等[10]報(bào)道，急性心肌梗死患者血漿中的miR-1、miR-133、miR-499以及miR-208a明顯高于健康對(duì)照者、非急性心肌梗死冠心病患者及其他心血管疾病患者，其漲幅最高為miR-133[11]，由此提示miR-133可作為急性心肌梗死診斷的理想生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示，miR-133在急性心肌梗死患者血漿中異常高表達(dá)。ECP治療7周后，治療組miR-133表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，并伴隨著心絞痛癥狀的明顯緩解。結(jié)合miR-133在外周血循環(huán)穩(wěn)定、可承受酶降解及反復(fù)凍融的特性[12]，以及肌鈣蛋白I在非急性冠脈綜合征如終末期腎臟疾病等疾病中亦可異常增加等缺點(diǎn)[13]，提示：①外周循環(huán)血miR-133可作為繼心肌酶譜、C反應(yīng)蛋白等標(biāo)志急性心肌梗死發(fā)生、發(fā)展的新型生物學(xué)標(biāo)志物；對(duì)于判斷腎功能障礙患者心肌損傷情況，miR-133檢測(cè)可能更優(yōu)于心肌肌鈣蛋白I。②ECP可有效改善急性心肌梗死患者心功能和心肌缺血狀態(tài)，其作用機(jī)制可能為ECP治療后減少了心肌細(xì)胞缺血壞死，miR-133由壞死心肌細(xì)胞中進(jìn)入到外周循環(huán)血明顯減少[12]。本研究由新的角度探討了急性心肌梗死發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制和ECP的治療機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步探討急性心肌梗死的治療奠定了一定基礎(chǔ)。

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Effects of external counterpulsation on the plasma expression level of microRNA-133 in patients with acute myocardial infarction

HUANG Ying, ZHAO Chunli, WEI Yongqiang

(Mingzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530001， Guangxi, China)

Abstract:Objective It is to observe the plasma expression level of microRNA-133(miRNA-133) in patients with acute myocardial infarction (AMI) and to investigate the effects of external counterpulsation(ECP) on this level. Methods 60 AMI patients of after PCI were randomly divided into the treatment group(n=30) and negative control group(n=30), and 30 cases outpatients of healthy physical examination as a blank control group (n=30).The plasma expression level of miRNA-133 in three groups were analyzed by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). The treatment group and the negative control group received conventional drug therapy for secondary prevention of coronary heart disease. And then the treatment group launch ECP at 3th weeks after PCI, 1 hour /time o d, 5 times a week for 7 weeks; miRNA-133 levels ,the improvement of angina symptoms and heart function in two groups of AMI patients were measured by qRT-PCR and echocardiographic indicators respectively after ECP treatment. Results Compared with the blank control group, the plasma expression levels of miRNA-133 in the AMI patients were significantly elevated(P<0.05); the level of miRNA-133 were significantly reduced in the AMI patients after 7 weeks ECP, accompany with clinical symptoms relieved and the echocardiography index of heart function markly improved(P<0.05). Conclusion Circulating miRNA-133 can be used as potential novel biomarker for AMI ; ECP obviously decreased the plasma level of miRNA-133 in AMI patients and improved cardiac function effectively.

Key words：external counterpulsation; microRNA-133；acute myocardial infarction

[收稿日期]2014-11-20

[中圖分類號(hào)]R0542.22

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)01-0025-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.008

[基金項(xiàng)目]廣西醫(yī)科大學(xué)青年科學(xué)基金項(xiàng)目(GXMUYSF201304)

[作者簡(jiǎn)介]黃穎，女，博士，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)樾募」Ｋ兰靶穆墒С！?/p>