高翔，張悅，張愛金，付芃，李佳琳，吳建，劉巍△

?

Roscovitine在衣霉素誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用

高翔1,2，張悅3，張愛金1，付芃1，李佳琳1，吳建1，劉巍1△

摘要：目的應(yīng)用衣霉素誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），觀察Roscovtine對(duì)ERS導(dǎo)致足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法體外培養(yǎng)永生化小鼠足細(xì)胞，取37℃分化成熟細(xì)胞隨機(jī)分組：（1）正常對(duì)照組、DMSO組及衣霉素Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組，各實(shí)驗(yàn)組分別刺激3、6、12 h。（2）正常對(duì)照組、Tunicamycin（1.0 μmol/L，TM）組及Tunicamycin+Rosco?vitine（20、40 μmol/L，TM+ROS）組，各實(shí)驗(yàn)組分別刺激12 h。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡情況；應(yīng)用Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5（Cdk5）及ERS標(biāo)志蛋白GRP78、Caspase-12、CHOP的表達(dá)變化。結(jié)果（1）與正常對(duì)照組和DMSO組相比，Tunicamycin刺激3、6及12 h后，TM組足細(xì)胞凋亡率及Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達(dá)水平均呈明顯的時(shí)間依賴性增高（P < 0.05）；（2）加入Roscovitine干預(yù)后，與TM組相比，TM+ROS（20、40 μmol/L）組足細(xì)胞凋亡率及GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P < 0.05），其干預(yù)作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。結(jié)論Cdk5抑制劑Roscovitine能顯著抑制衣霉素誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。Roscovitine的足細(xì)胞保護(hù)作用可能有助于糖尿病腎病的治療。

關(guān)鍵詞：足細(xì)胞；凋亡；衣霉素；細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶5；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；Roscovitine

△通訊作者E-mail：lwei929@126.com

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病重要的血管并發(fā)癥，是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的重要原因之一。研究顯示，足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，其損傷在DN蛋白尿和腎小球硬化的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用[1]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（en?doplasmic reticulum stress，ERS）是細(xì)胞對(duì)各種有害刺激最為關(guān)鍵的應(yīng)答機(jī)制，而過度ERS可直接導(dǎo)致細(xì)胞功能異常甚至死亡。已有研究顯示，過度ERS導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[2]。因此，有效地抑制ERS可能會(huì)成為治療DN的新方向。然而，目前尚沒有針對(duì)DN的特異性ERS抑制劑。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，1型糖尿病大鼠的細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶（Cdk）5在足細(xì)胞的表達(dá)較正常對(duì)照大鼠明顯增高，Cdk5參與了ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程，并與大鼠腎功能受損程度密切相關(guān)；而Cdk5抑制劑Roscovitine能明顯改善糖尿病大鼠的腎功能，減輕腎組織病變程度[3]。但是，Roscovitine發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過衣霉素（Tunicamycin，TM）誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，探討Roscovitine對(duì)足細(xì)胞過度ERS的影響，以期為DN的治療提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料條件性永生化小鼠足細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。Cdk5抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；β-actin、GRP78購(gòu)自美國(guó)SAB公司；Caspase-12購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；CHOP購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。TM、Roscovitine和Ⅰ型膠原蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。重組小鼠γ-干擾素（γ-interferon，γ-IFN）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司。TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)條件性永生化小鼠足細(xì)胞培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)[4]。培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板底部均預(yù)先鋪被0.1 g/L的Ⅰ型膠原蛋白。未分化足細(xì)胞用含有10%胎牛血清（FBS）、20 U/mL γ-IFN、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在33℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖傳代（許可條件）。許可條件下培養(yǎng)的足細(xì)胞按1∶10傳代后，在37℃用不添加γ-IFN的DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素）培養(yǎng)10～15 d（非許可條件），誘導(dǎo)足細(xì)胞分化成熟。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組足細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（1）觀察TM對(duì)足細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響，細(xì)胞分組：正常對(duì)照（Control）組、DMSO組、TM（1.0 μmol/L）組，分別刺激3、6、12 h。（2）觀察Roscovitine對(duì)TM誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)的影響，細(xì)胞分組如下：正常對(duì)照（Control）組；TM（1.0 μmol/L）組；TM+Roscovitine（20、40 μmol/L，TM+ ROS）組，各實(shí)驗(yàn)組分別刺激12 h。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)足細(xì)胞凋亡按1.2.2（1）、（2）分組并培養(yǎng)細(xì)胞，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞刺激結(jié)束后，加入胰酶-EDTA消化細(xì)胞，室溫1 000 r/min離心4 min，棄上清，加生理鹽水洗滌2次。收集1×105個(gè)細(xì)胞，并加入500 μL Binding buffer，反復(fù)吹打均勻制成單細(xì)胞懸液；分別加入5 μL FITC標(biāo)記的An? nexin V和5 μL碘化丙啶(PI)，混勻后避光室溫孵育10 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，計(jì)算各組細(xì)胞Annexin-FITC 和PI染色細(xì)胞百分含量。

1.2.4Western blot檢驗(yàn)相關(guān)蛋白表達(dá)按1.2.2（1）、（2）分組并培養(yǎng)細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，提取總蛋白并行Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平。各組蛋白樣品分別取100 μg總蛋白，加6×上樣緩沖液，100℃變性5 min，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入Cdk5（1∶1 000）、GRP78（1∶1 000）、Caspase-12（1∶500）、CHOP（1∶1 000）和β-actin（1∶2 000）抗體，4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或鼠免疫球蛋白（Ig）G（1∶5 000），37℃孵育2 h。TBST洗膜后，滴加ECL試劑，于Odyssey FC圖像采集成像系統(tǒng)中顯影，并對(duì)條帶進(jìn)行定量分析。以目的條帶和β-actin條帶積分光密度值比值作為最終結(jié)果。

1.2.5TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法，按試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。凋亡足細(xì)胞核呈綠色熒光。每張切片于凋亡細(xì)胞分布區(qū)域隨機(jī)讀取10個(gè)高倍視野，計(jì)算出平均每100個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)（%）表示凋亡百分率，每張切片重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較用LSD-t法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1TM對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響TM分別處理3、6及12 h后，與對(duì)照組和DMSO組相比，TM組足細(xì)胞凋亡率均增高（P < 0.05）。同時(shí)，TM對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響呈明顯的時(shí)間依賴性（P < 0.05），見表1、圖1。

2.2TM對(duì)足細(xì)胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12、CHOP表達(dá)的影響與Control組和DMSO組相比，TM刺激3、6及12 h后，足細(xì)胞中Cdk5、GRP78、Caspase-12及CHOP蛋白的表達(dá)水平均顯著增高（均P < 0.05），并呈明顯的時(shí)間依賴性（P < 0.05），見表2、圖2。

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細(xì)胞的凋亡率（n=3，%，±s）

Tab.1 The podocyte apoptotic rates treated by TM in three groups表1　TM處理后各組足細(xì)胞的凋亡率（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與DMSO組比較；A與3 h組比較；B與6 h組比較，P < 0.05

組別Control組DMSO組TM組F 3 h 3.26±0.74 3.11±0.29 13.79±0.95ab265.66＊6 h 2.99±0.39 3.16±0.62 22.38±1.61abA481.13＊12 h 4.36±0.94 3.97±0.56 34.87±2.56abAB522.96＊F 6.35 0.17 328.71＊

Fig.1 The podocyte apoptotic rates after TM treatment in four groups圖1　TM刺激后各組足細(xì)胞凋亡率

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細(xì)胞蛋白表達(dá)的積分光密度值（n=3，±s）

Tab. 2 The integrated optical density of proteins after TM treatment in four groups表2　TM刺激后各組足細(xì)胞蛋白表達(dá)的積分光密度值（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較,b與DMSO組比較,c與TM 3 h組比較，d與TM 6 h組比較,P＜0.05

組別Control組DMSO組TM 3 h組TM 6 h組TM 12 h組F Cdk5 0.17±0.05 0.24±0.06 0.51±0.09ab0.67±0.03abc0.83±0.06abcd56.45＊GRP78 0.42±0.13 0.40±0.08 0.86±0.05ab1.09±0.13abc1.33±0.17abcd34.41＊Caspase-12 0.16±0.03 0.24±0.02 0.41±0.09ab0.53±0.05abc0.66±0.08abcd33.55＊CHOP 0.06±0.03 0.06±0.02 0.34±0.08ab0.59±0.07abc0.78±0.06abcd96.14＊

Fig.2 Expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP after TM treatment in four groups圖2　TM刺激后各組Cdk5、GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達(dá)情況

2.3Roscovitine對(duì)TM誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響TM組足細(xì)胞凋亡率高于Control組、TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組，并且TM+ROS（40 μmol/L）組細(xì)胞凋亡率低于TM+ROS（20 μmol/L）組，Control組凋亡率最低（均P < 0.05）。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用Roscovitine干預(yù)后，TM+ROS組足細(xì)胞凋亡率均顯著低于TM組（均P < 0.05），見表3、圖3。

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細(xì)胞術(shù)和Tunel檢測(cè)Roscovitine處理后足細(xì)胞凋亡率?。╪=3，%，±s）

Tab. 3 Podocyte apoptotic rates detected by flow cytometry and TUNEL after roscovitine treatment表3　流式細(xì)胞術(shù)和Tunel檢測(cè)Roscovitine處理后足細(xì)胞凋亡率?。╪=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較；b與TM組比較；c與TM+ROS(20 μmol/L)組比較，P < 0.05；表4同

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F流式細(xì)胞術(shù)4.82±0.60 37.96±3.54a21.63±1.31ab14.04±1.77abc177.20＊TUNEL 3.19±0.52 38.46±3.31a20.97±1.31ab14.18±1.02abc238.42＊

Fig. 3 The podocyte apoptosis detected by TUNEL (×400)圖3　TUNEL法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡（×400）

2.4Roscovitine對(duì)TM誘導(dǎo)足細(xì)胞中GRP78、Cas?pase-12和CHOP表達(dá)的影響與TM組相比，TM+ROS(20 μmol/L)組和TM+ROS(40 μmol/L)組足細(xì)胞中GRP78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達(dá)水平降低（P < 0.05），并且TM+ROS(40 μmol/L)組較TM+ROS(20 μmol/L)組的作用效果更顯著，但這2組蛋白表達(dá)水平仍高于Control組（P < 0.05），見表4、圖4。

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細(xì)胞蛋白表達(dá)的積分光密度值?。╪=3，±s）

Tab. 4 The integrated optical density of proteins after roscovitine treatment表4　Roscovitine處理后各組足細(xì)胞蛋白表達(dá)的積分光密度值?。╪=3，±s）

組別Control組TM組TM+ROS(20 μmol/L)組TM+ROS(40 μmol/L)組F GRP78 0.46±0.05 2.23±0.38a1.48±0.08ab0.94±0.12abc40.51＊Caspase-12 0.33±0.04 1.88±0.07a0.81±0.08ab0.48±0.05abc349.56＊CHOP 0.28±0.06 2.33±0.38a1.16±0.16ab0.71±0.03abc53.54＊

Fig. 4 Expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP after roscovitine treatment in four groups圖4　Roscovitine處理后各組GRP78、Caspase-12和CHOP蛋白的表達(dá)情況

3　討論

足細(xì)胞是一種終末分化的腎小球上皮細(xì)胞，附著于腎小球基底膜外側(cè)，是參與構(gòu)成腎小球?yàn)V過屏障的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。足細(xì)胞數(shù)目及密度的下降是導(dǎo)致DN蛋白尿產(chǎn)生和腎小球硬化的重要原因。凋亡是造成足細(xì)胞數(shù)目減少的重要原因之一[5]。

一般情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常生理功能主要是折疊、修飾和降解分泌蛋白和跨膜蛋白；生理和病理狀態(tài)下，大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蓄積會(huì)導(dǎo)致ERS的發(fā)生。糖尿病狀態(tài)下，高糖、ROS、游離脂肪酸、糖基化終產(chǎn)物等因素會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量未折疊蛋白的產(chǎn)生，從而誘發(fā)ERS。ERS導(dǎo)致腎臟固有細(xì)胞，如系膜細(xì)胞、足細(xì)胞凋亡，是促進(jìn)DN發(fā)生發(fā)展的重要因素[6-7]。因此，抑制ERS可能成為治療DN的一個(gè)重要方法。為了研究DN進(jìn)展中ERS對(duì)足細(xì)胞的影響，本研究采用TM刺激足細(xì)胞，誘導(dǎo)ERS的發(fā)生，結(jié)果顯示，TM處理后足細(xì)胞內(nèi)ERS標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)水平高于Control組，并且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，ERS相關(guān)凋亡蛋白Caspase-12和CHOP的表達(dá)水平及足細(xì)胞的凋亡率也有增高，提示TM的刺激可以誘導(dǎo)足細(xì)胞ERS及凋亡的發(fā)生。

ERS發(fā)生后主要通過ATF6、IRE1和PERK三種跨膜蛋白傳遞信號(hào)，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，從而減輕細(xì)胞損傷或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。然而，目前尚不清楚是否有其他蛋白介導(dǎo)了ERS引起的細(xì)胞凋亡過程。Cdk5是Cdk家族的特殊成員，是脯氨酸限制性絲/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)。在氧化應(yīng)激、高血糖、缺氧等因素下，Cdk5可被過度激活并過度磷酸化某些底物，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，參與多種疾病的發(fā)生[8]。腎組織中，Cdk5表達(dá)于足細(xì)胞中，對(duì)維持足細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)及功能有重要作用[9]。在高糖環(huán)境中，足細(xì)胞中Cdk5的表達(dá)水平及激酶活性有顯著的增高，而抑制Cdk5的表達(dá)可以顯著降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，Cdk5的過度表達(dá)及過度激活是導(dǎo)致糖尿病足細(xì)胞凋亡的原因[10]。Kang等[11]發(fā)現(xiàn)，Cdk5參與了常染色體顯性色素性視網(wǎng)膜炎中ERS導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡過程，但其是否參與ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程尚不清楚。本研究顯示，TM處理后，足細(xì)胞中Cdk5的蛋白表達(dá)水平顯著高于Control組，并呈明顯的時(shí)間依賴性，提示ERS可能通過提高Cdk5的表達(dá)水平而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。

Roscovitine是一種強(qiáng)效的二代細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，對(duì)Cdk5的激酶活性具有高效的抑制作用[12]。高濃度Roscovitine處理Heymann腎炎大鼠模型結(jié)果顯示，其對(duì)腎小球中足細(xì)胞有很好的保護(hù)作用[13]。筆者前期研究顯示，應(yīng)用Roscovi?tine處理糖尿病大鼠，能夠有效地減輕糖尿病大鼠腎功能的損傷及病理改變，具有明顯的腎臟保護(hù)作用[3]。本研究顯示TM誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡可以被Roscovitine抑制，足細(xì)胞凋亡率在Roscovitine干預(yù)組顯著低于單純TM處理組，并且40 μmol/L的干預(yù)效果顯著優(yōu)于20 μmol/L組。同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，Roscovintine的干預(yù)可以顯著降低足細(xì)胞中ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP和Caspase-12的表達(dá)水平，表明Cdk5明顯參與了ERS誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡過程，采用Roscovitine抑制Cdk5活性對(duì)降低ERS導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡具有良好的效果，具有一定的腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，在DN發(fā)展過程中，ERS可通過增強(qiáng)Cdk5的表達(dá)而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，抑制Cdk5可能會(huì)成為治療DN的新靶點(diǎn)。雖然大量體內(nèi)外研究證實(shí)Roscovitine可通過抑制Cdk5發(fā)揮神經(jīng)、腎臟等保護(hù)功能，并且可以從不同方面干預(yù)DN的進(jìn)展，然而還缺乏長(zhǎng)期、大量的臨床研究證實(shí)。本研究結(jié)果為DN的防治提供了新的思路和方向。

參考文獻(xiàn)

[1] Reidy K, Kang HM, Hostetter T, et al. Molecular mechanisms of dia?betic kidney disease [J]. J Clin Invest, 2014, 124(6):2333-2340. doi: 10.1172/JCI72271.

[2] Zhuang A, Forbes JM. Stress in the kidney is the road to pERdition: is endoplasmic reticulum stress a pathogenic mediator of diabetic nephropathy [J]? J Endocrinol, 2014, 222(3):R97-111. doi: 10.153 0/JOE-13-0517.

[3] Zhang Y, Zhou Y, Zhang Y, et al. Effects of Cdk5 inhibitor Roscovi?tine on renal function and nestin expression in diabetic rat [J]. Chi?nese Pharmacological Bulletin, 2013, 29(8):1077-1078. [張悅,周毅，張怡,等. Cdk5抑制劑Roscovitine對(duì)糖尿病大鼠腎功能及nestin表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2013, 29(8):1077-1078].

[4] Mundel P, Reiser J, Zú?iga Mejía Borja A, et al. Rearrangements of the cytoskeleton and cell contacts induce process formation during differentiation of conditionally immortalized mouse podocyte cell lines [J]. Exp Cell Res, 1997, 236:248-258.

[5] Anil Kumar P, Welsh GI, Saleem MA, et al. Molecular and cellular events mediating glomerular podocyte dysfunction and depletion in diabetes mellitus [J]. Front Endocrinol (Lausanne), 2014, 5:151. doi: 10.3389/fendo.2014.00151.

[6] Madhusudhan T, Wang H, Dong W, et al. Defective podocyte insu?lin signalling through p85-XBP1 promotes ATF6-dependent mal?adaptive ER-stress response in diabetic nephropathy [J]. Nat Com?mun, 2015, 6:6496. doi: 10.1038/ncomms7496.

[7] Ding Y, Choi ME. Autophagy in diabetic nephropathy [J]. J Endocri? nol, 2015, 224(1):R15-30. doi: 10.1530/JOE-14-0437.

[8] Arif A. Extraneuronal activities and regulatory mechanisms of the atypical cyclin- dependent kinase Cdk5 [J]. Biochem Pharmacol, 2012, 84(8):985-993. doi: 10.1016/j.bcp.2012.06.027.

[9] Griffin SV, Hiromura K, Pippin J, et al. Cyclin-dependent kinase 5 is a regulator of podocyte differentiation, proliferation, and morphol?ogy [J]. Am J Pathol, 2004, 165(4):1175-1185.

[10] Zhang Y, Li H, Hao J, et al. High glucose increases Cdk5 activity in podocytes via transforming growth factor-β1 signaling pathway [J]. Exp Cell Res, 2014, 326(2):219- 229. doi: 10.1016/j.yex?cr.2014.04.014.

[11] Kang MJ, Chung J, Ryoo HD. CDK5 and MEKK1 mediate proapoptotic signalling following endoplasmic reticulum stress in an au?tosomal dominant retinitis pigmentosa model [J]. Nat Cell Biol, 2012, 14(4): 409-415. doi: 10.1038/ncb2447.

[12] Le Tourneau C, Faivre S, Laurence V, et al. Phase I evalua?tion of seliciclib (R- roscovitine), a novel oral cyclin- dependent ki?nase inhibitor, in patients with advanced malignancies [J]. Eur J Cancer, 2010, 46(18):3243-3250. doi: 10.1016/j.ejca.2010.08.001.

[13] Milovanceva-Popovska M, Kunter U, Ostendorf T, et al. R-rosocvi?tine (CYC202) alleviates renal cell proliferation in nephritis without aggravating podocyte injury [J]. Kidney Int, 2005, 67(4):1362-1370. doi:10.1111/j.1523-1755.2005.00213.x.

（2015-06-08收稿2015-08-24修回）

（本文編輯陸榮展）

作者單位：1河北醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室（郵編050017）；2河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血管外科；3河北醫(yī)科大學(xué)診斷學(xué)教研室

The role of roscovitine in tunicamycin induced podocyte injury

GAO Xiang1, 2, ZHANG Yue3, ZHANG Ai′jin1, FU Peng1, LI Jialin1, WU Jian1, LIU Wei1△
1 Department of Pathology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China; 2 Department of Vascular Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University, 3 Department of Diagnostics, Hebei Medical University
△Corresponding Author E-mail: lwei929@126.com

Abstract:Objective To observe the protective effects of roscovitine on the podocyte injury induced by endoplasmic reticulum stress (ERS) caused by tunicamycin. Methods The differentiated podocytes cultured at 37℃were randomly di?vided into: (1) Control group, DMSO group and tunicamycin group (TM, 1.0 μmol/L). The treatment was given for 3, 6 and 12 hours in three groups. (2) For control group, tunicamycin group, tunicamycin+roscovitine group (20, 40 μmol/L, TM+ROS), the treatment was given for 12 hours. The podocyte apoptosis was detected by flow cytometry and TUNEL method. The ex?pressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were detected by Western blot assay. Results (1) Compared with con?trol group and DMSO group, the podocyte apoptosis was increased significantly in a time dependent manner after tunicamy?cin treatment in TM group; the protein expressions of Cdk5, GRP78, Caspase-12 and CHOP were also up-regulated signifi?cantly in TM group (P < 0.05). (2) Flow cytometry and TUNEL analysis showed that tunicamycin induced apoptosis in podo?cytes, which was significantly inhibited by roscovitine in a concentration dependent manner in TM+ROS group as compared to that of TM group (P < 0.05). The protein expressions of GRP78, Caspase-12 and CHOP were also significantly decreased in a concentration dependent manner in TM+ROS group compared to those of TM group (P < 0.05). Conclusion Roscovi?tine, the inhibitor of Cdk5, can reduce the podocyte apoptosis induced by tunicamycin. The protective effects of roscovitine on podocytes can be a novel approach of treating diabetic nephropathy.

Key words:podocyte; apoptosis; Tunicamycin; Cdk5; endoplasmic reticulum stress; Roscovitine

中圖分類號(hào)：R692.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.11958/59025

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81400731）；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（H2013206139，H2015206257）；河北省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)重點(diǎn)科技研究計(jì)劃項(xiàng)目（20130140）；河北醫(yī)科大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃資助項(xiàng)目（201410089018）

作者簡(jiǎn)介：高翔（1982），男，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病血管病變研究