劉雅妍,羅文輝,梁曉紅

(湖南省株洲市中心醫(yī)院 皮膚科, 湖南 株洲　412007)

?

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

人PPIL6基因的克隆與原核蛋白表達

劉雅妍,羅文輝,梁曉紅

(湖南省株洲市中心醫(yī)院 皮膚科, 湖南 株洲412007)

[摘要]目的 克隆1個新的人類脯氨酸異構(gòu)酶基因PPIL6(peptidylprolyl isomerase-like 6), 并通過原核表達獲得重組蛋白進行生化活性鑒定。方法 通過PCR進行基因克隆。通過熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)分析PPIL6的組織分布。通過EGFP融合蛋白觀察PPIL6的細胞定位。通過大腸桿菌原核表達獲得PPIL6重組蛋白。通過表面等離子共振技術(shù)檢測PPIL6與CsA的相互作用。通過分光光度法檢測CsA對PPIL6的抑制。結(jié)果 PPIL6存在2個轉(zhuǎn)錄本(PPIL6a和PPIL6b), 在脯氨酸異構(gòu)酶家族中屬于一個獨立的分支。PPIL6在不同組織中廣泛表達, 并在腎小管中有強染色。PPIL6定位于HeLa細胞的細胞核中。PPIL6能夠與CsA結(jié)合, 并且其活性受CsA抑制。結(jié)論 克隆到1個新的人類脯氨酸異構(gòu)酶基因PPIL6, 可能在細胞核中發(fā)揮基因表達調(diào)控的功能。

[關(guān)鍵詞]脯氨酸異構(gòu)酶; 綠色熒光蛋白; 細胞定位; 表面等離子共振

脯氨酸異構(gòu)酶(peptide-prolyl isomerases, PPIase)能夠催化蛋白質(zhì)中脯氨酸氮端肽鍵的順反異構(gòu)[1]。脯氨酸異構(gòu)酶包括3個大的亞家族：親環(huán)素(cyclophilin)、FK506結(jié)合蛋白(FKBP)和parvulin。脯氨酸異構(gòu)酶能夠加速蛋白折疊和成熟, 在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要功能[1]。比如, PPIA在許多腫瘤中表達升高, 并促進腫瘤生長[2-4], PPID是線粒體滲透轉(zhuǎn)換孔的組成成分[5], 在乳腺癌中表達升高、抑制腫瘤細胞凋亡[6]。PPIL1在結(jié)腸癌中表達升高, 通過SNW1/SKIP和/或stathmin7促進細胞增殖[7]。發(fā)現(xiàn)新的PPIase有助于認識和研究人類疾病。本實驗報道了1個新PPIL6基因的克隆、序列及定位分析、蛋白重組表達, 以及生化性質(zhì)研究。

1材料與方法

1.1 實驗材料人多種組織cDNA文庫和pEGFP-N1載體購于Clontech公司。PCR試劑盒、pMD18-T載體、熒光定量PCR試劑盒、BL21大腸桿菌菌株購于Takara公司。PCR產(chǎn)物回收試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司。Ppil6抗體購于Santa Cruz公司。PET-28a原核表達載體、鎳柱填料、CM5傳感芯片購于GE公司。PCR引物在上海生工合成。Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑購買于Invitrogen公司。

1.2人PPIL6基因的克隆根據(jù)人PPIL6的cDNA序列設(shè)計克隆引物(上游引物: 5′-CCT TTT CCT CCA AGC TCG TC-3′; 下游引物: 5′-GGG AGG GAT TGG GTG TAG AT-3′)。以人皮膚cDNA文庫為模板進行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)。PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體, 并利用載體引物進行測序。2個剪切本PPIL6a和PPIL6b的序列提交至GenBank, 序列號分別為DQ363562.1和DQ423529.1。

1.3 序列分析PPIL6a和PPIL6b的cDNA分析在UCSC基因組網(wǎng)站(http://www.genome.ucsc.edu)進行。結(jié)構(gòu)域分析在SMART網(wǎng)站(http://smart.embl-heidelberg.de)進行。分子量和等電點分析在Expasy網(wǎng)站(http://cn.expasy.org/tools/)進行。多序列比對用Clustal X軟件進行分析[8], 并利用BioEdit軟件作圖。用來比對的PPIL6蛋白包括:Daniorerio(NP_001018433.1)、Xenopuslaevis(NP_001088675.1)、Gallusgallus(XP_419794.2)、Musmusculus(NP_082706.1)以及Homosapiens(ABC88651.1, PPIL6a)。系統(tǒng)進化樹用TreeView軟件繪制, 采用的序列為PPIA(NP_066953.1)、 PPIB(NP_000933.1)、PPIC(NP_000934.1)、PPID(NP_005029.1)、PPIE(NP_006103.1)、PPIF(NP_005720.1)、PPIG(NP_004783.2)、PPIH(NP_006338.1)、PPIL1(NP_057143.1)、PPIL2(NP_055152.1)、PPIL3(NP_115861.1)、PPIL4(NP_624311.1)、PPIL5(NP_689542.2)、PPIL6a(ABC88651.1)以及PPIL6b(ABD83948.1)。

1.4PPIL6的組織表達譜分析熒光定量PCR在iCycler熒光定量PCR儀(Bio-Rad)上進行, Ct值由分析軟件得出，并用于計算擴增產(chǎn)物的相對表達量。PPIL6的PCR引物為:5′- GGC GCA AAG TTG AGG AAA GG - 3′(正向), 5′- TCT TCA GAT TCT CAG CGG CG - 3′(反向);β-actin的PCR引物為: 5′-CTC ACC ATG GAT GAT GAT ATC GC- 3′(正向), 5′-AGG AAT CCT TCT GAC CCA TGC- 3′(反向)。β-actin的表達量用作內(nèi)參來計算PPIL6在不同組織內(nèi)的相對表達量。

1.5 Ppil6的免疫組化分析小鼠新鮮腎臟組織在恒冷冰凍切片機內(nèi)切片, 厚度為5～6 μm。用Ppil6特異的抗體參考標準方法進行免疫組化染色[9]。

1.6 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在37 ℃, 5% CO2條件下, HeLa細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM中。細胞傳代后24 h后使用脂質(zhì)體(lipofectamine 2000)進行不同質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染, 轉(zhuǎn)染4 h 后換液。

1.7PPIL6的細胞定位將PPIL6a和PPIL6b的全長開放閱讀框克隆入pEGFP-N1載體, 并將表達融合蛋白的質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至HeLa細胞。轉(zhuǎn)染24 h后, 細胞用PBS洗滌2次, 每次5 min, 并用4%多聚甲醛固定。EGFP融合蛋白直接通過熒光顯微鏡觀察(Leica DM RA2), 并用Leica DC500相機成像。

1.8PPIL6蛋白的原核表達純化將PPIL6a的全長開放閱讀框克隆入PET-28a原核表達載體, 并轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌菌株。挑取單克隆, 在5 mL LB培養(yǎng)基中37 ℃、200 rpm培養(yǎng)過夜獲得種子液。將種子液加入500 mL LB培養(yǎng)基中, 37 ℃、200 rpm培養(yǎng)至OD600>0.6, 加入終濃度300 μmol/L的IPTG, 繼續(xù)培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)完成后于4 ℃、5 000 g、離心15 min收集菌體。將細胞沉淀完全重懸于10 mL預(yù)冷的PBS中, 將沉淀超聲破碎、低溫高速離心, 將上清過鎳柱并用咪唑洗脫, 超濾去除咪唑后獲得溶解于PBS中的PPIL6純化蛋白。

1.9PPIL6蛋白與CsA的相互作用檢測測定重組蛋白的濃度, 確定蛋白濃度高于200 μg/mL, 避免使用Tris緩沖液進行蛋白耦連。用最適pH的醋酸鈉緩沖液將蛋白稀釋至合適的濃度, 并且按照BIAcore 3000儀器的說明進行蛋白耦連。將CsA用DMSO(100%)配制成10 mmol/L的母液, 之后用含1/100 DMSO(v/v)的HBS-EP緩沖液將母液對半稀釋成6個濃度梯度(最高濃度為0.625 μmol/L)。將樣品離心后進樣, 每個樣品重復(fù)3次。進樣流速為40 μL/min, 進樣體積為50 μL, 測試溫度為20 ℃。一個樣品進樣完成后, 用再生緩沖液洗去未充分解離的配體。最后在分析軟件中進行曲線擬合和數(shù)據(jù)分析。

1.10CsA抑制PPIL6酶活的檢測將Suc-AAPF-pNA多肽底物溶解于含有480 nmol/L LiCl的TFE中, 使其終濃度達到3 mmol/L; 將α-胰凝乳蛋白酶用1 mmol/L HCl溶解至終濃度42 mg/mL。在94 μL酶活測試緩沖液中加入不同濃度的CsA, 并加入2 μL PPIL6儲存緩沖液(蛋白濃度為5 μmol/L), 冰上放置3 h。對照組中不加CsA; 空白組不加入CsA和PPIL6蛋白。在上述混合溶液中加入2 μL底物緩沖液和2 μL α-胰凝乳蛋白酶緩沖液, 迅速混勻并做時間掃描, 連續(xù)測定A390值, 吸光度對時間的斜率代表其酶促反應(yīng)速率。計算公式為: 化合物對PPIase活性的抑制率(%)=[(對照組-實驗組) / (對照組-空白組)] × 100%。

2結(jié)果

2.1PPIL6的基因克隆為了克隆新的脯氨酸異構(gòu)酶(PPIase)蛋白家族成員, 我們將PPIA/CYPA的cDNA序列提交至人EST數(shù)據(jù)庫進行序列檢索, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了1條EST序列BX109113.1。通過EST步移法, 拼接出1條全長的cDNA, 并通過其編碼氨基酸的序列, 將其命名為PPIL6(PPIase-like 6)。然后通過設(shè)計PCR引物, 從人皮膚cDNA文庫中獲得了PPIL6的全長序列。測序分析發(fā)現(xiàn), 我們同時還獲得了1個PPIL6的可變剪接體。將這2個序列分別命名為PPIL6a和PPIL6b, 并提交至GeneBank, 收錄號分別為DQ363562.1和DQ423529.1。

2.2 PPIL6的序列分析PPIL6a的基因組信息如圖所示(見圖1A)。它位于人的6號染色體長臂(6q21), 由8個外顯子組成。PPIL6b的基因組信息如圖所示(見圖1B), 其基因位點與PPIL6a相同, 只不過在第6個外顯子后插入了1個新的外顯子。PPIL6的cDNA序列如圖1C所示, 圖中用灰色顯示的序列是PPIL6b中插入的序列及其編碼的氨基酸。PPIL6a的開放閱讀框(ORF)長度為936 bp, 編碼312個氨基酸;PPIL6b的開放閱讀框長度為1 014 bp, 編碼338個氨基酸。為了分析PPIL6的家族蛋白信息及其進化保守性, 從NCBI網(wǎng)站獲得了不同物種PPIL6及人不同PPIase成員的蛋白序列。蛋白序列比對顯示，該蛋白在進化上高度保守, 其中人PPIL6a的第145位氨基酸之后的序列為一個保守的PPIase結(jié)構(gòu)域(見圖2A)。另外, 將人的PPIase蛋白及其類似蛋白的氨基酸序列與PPIL6一起進行系統(tǒng)進化分析可以看出, PPIL6a和PPIL6b在進化上形成的是一個獨立的分支(見圖2B), 與其他PPIase成員并不相同, 提示了它可能具有獨特的功能。2.3 PPIL6的組織表達與細胞定位分析為了解PPIL6在不同組織中的表達情況, 利用熒光定量PCR檢測了PPIL6的mRNA在人17種cDNA種的豐度, 并使用β-actin的表達量用作內(nèi)參。從圖3A中可以看出,PPIL6是一個在各種組織中廣譜表達的基因, 提示其可能參與基本的生物學(xué)過程。由于PPIL6在腎臟中的表達量較高, 我們對小鼠腎臟切片進行了免疫組化分析, 發(fā)現(xiàn)Ppil6高表達于腎小管上皮細胞(見圖3B)，提示該基因可能參與重吸收和排泄過程。將編碼EGFP:PPIL6融合蛋白的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HeLa細胞中, 通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)PPIL6定位于細胞核中(見圖3C)。

2.4 PPIL6a的原核蛋白表達與生化性質(zhì)分析為了更深入地了解PPIL6的蛋白性質(zhì), 我們將PPIL6a的開放閱讀框克隆進PET28a表達載體, 并通過IPTG在BL21大腸桿菌菌株中誘導(dǎo)蛋白表達。蛋白誘導(dǎo)表達后, 通過鎳柱親和層析獲得純度高于95%的PPIL6a重組蛋白(圖4A)。由于與環(huán)孢菌素A(CsA)結(jié)合是PPIase蛋白的基本特性, 因此將PPIL6a重組蛋白偶聯(lián)在BIAcore3000分子相互作用儀的CM5傳感芯片上, 并將CsA以不同濃度從芯片表面流過, 獲得親和解離曲線(見圖4B)。由圖可知, PPIL6a與CsA的結(jié)合具有濃度依賴性。通過軟件計算, PPIL6a與CsA的KD值為2.18×10-7mol/L。通過體外酶活實驗將重組表達的PPIL6a與CsA結(jié)合, 并與底物孵育, 發(fā)現(xiàn)CsA能夠抑制PPIL6a的脯氨酸轉(zhuǎn)移酶活性, IC50為0.45 μmol/L(見圖4C)。以上實驗證明, PPIL6是一個新的脯氨酸異構(gòu)酶家族成員。

A: PPIL6a的基因組結(jié)構(gòu); B: PPIL6b的基因組結(jié)構(gòu); C: PPIL6的cDNA序列及其編碼蛋白?；疑珵镻PIL6b相對于PPIL6a插入的序列及其編碼氨基酸。圖1　PPIL6的基因組結(jié)構(gòu)及cDNA序列

A: 不同物種中PPIL6的蛋白序列比對; B: PPIase蛋白家族成員的聚類分析。圖2　PPIL6的蛋白序列及脯氨酸異構(gòu)酶家族的進化分析

A: PPIL6在人不同組織中的表達量分析; B: 免疫組化分析Ppil6在小鼠腎臟組織中的表達分布情況;C: PPIL6a和PPIL6b的細胞定位。圖3　PPIL6的組織表達及細胞定位分析

A: PPIL6a蛋白的原核表達純化結(jié)果; B: 表面等離子共振技術(shù)分析PPIL6a與CsA的結(jié)合;C: CsA對PPIL6a酶活的抑制曲線。圖4　PPIL6a蛋白的表達純化與生化性質(zhì)分析

3討論

脯氨酸異構(gòu)酶(PPIase)是生物體內(nèi)存在的一大類分子伴侶蛋白[10]。脯氨酸異構(gòu)酶可以穩(wěn)定脯氨酰胺鍵的順式-反式過渡態(tài), 并且加速異構(gòu)化過程, 這對蛋白質(zhì)折疊是非常重要的[11]。親環(huán)素是脯氨酸異構(gòu)酶中的一類，在許多生理和病理過程中發(fā)揮重要功能，比如細胞凋亡[12]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[13]、病毒入侵和包裝[14-15]、腫瘤[16-17]等。發(fā)現(xiàn)新的親環(huán)素成員對于深入研究該類蛋白的功能具有重要的價值。

本研究以親環(huán)素PPIA/CYPA的序列為“誘餌”，通過表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)“步移”技術(shù)[18]，成功克隆了一個新的人類脯氨酸異構(gòu)酶編碼基因PPIL6, 并進一步發(fā)現(xiàn)該基因存在PPIL6a和PPIL6b兩個可變剪切本。序列分析表明PPIL6在進化上較為保守, 并且在脯氨酸異構(gòu)酶里是一個獨立的群體。表達分析表明,PPIL6在多種組織中廣泛表達, 并且在腎臟中高度表達于腎小管上皮細胞, 可能參與滲透等過程;PPIL6定位于細胞核中。生化分析表明,PPIL6能夠與CsA結(jié)合, 并且其活性能夠被CsA抑制。EGFP融合蛋白技術(shù)顯示，PPIL6定位在細胞核中。這些結(jié)果提示，PPIL6可能在細胞核中參與了基因表達調(diào)控，而使用CsA及其結(jié)構(gòu)類似物則能夠?qū)PIL6的功能進行阻斷，具有潛在的應(yīng)用價值。

[參考文獻]

[1] Gothel S F, Marahiel M A. Peptidyl-prolyl cis-trans isomerases, a superfamily of ubiquitous folding catalysts[J]. Cell Mol Life Sci, 1999, 55(3): 423-436.

[2] Zhu D, Wang Z, Zhao J J, et al. The Cyclophilin A-CD147 complex promotes the proliferation and homing of multiple myeloma cells[J]. Nat Med, 2015, 21(6): 572-580.

[3] Obchoei S, Weakley S M, Wongkham S, et al. Cyclophilin A enhances cell proliferation and tumor growth of liver fluke-associated cholangiocarcinoma[J]. Mol Cancer, 2011, 26(10): 102.

[4] Bonfils C, Bec N, Larroque C, et al. Cyclophilin A as negative regulator of apoptosis by sequestering cytochromec[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 393(2): 325-330.

[5] Baines C P, Kaiser R A, Purcell N H, et al. Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death[J]. Nature, 2005, 434(7033): 658-662.

[6] Wei L, Zhou Y, Dai Q, et al. Oroxylin A induces dissociation of hexokinase II from the mitochondria and inhibits glycolysis by SIRT3-mediated deacetylation of cyclophilin D in breast carcinoma[J]. Cell Death Dis, 2013, 4: e601.

[7] Obama K, Kato T, Hasegawa S, et al. Overexpression of peptidyl-prolyl isomerase-like 1 is associated with the growth of colon cancer cells[J]. Clin Cancer Res, 2006, 12(1): 70-76.

[8] 黃健，黃美容，駱詩露，等. 淋球菌OmpA蛋白的克隆表達、保守性及抗原表位分析[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015, 38(3)：261-265.

[9] 雷微, 陳永艷, 袁偉, 等. 皮膚鱗狀細胞癌皮損中p-Akt,p-Stat3,CyclinD1的表達及意義[J]. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2015, 38(3)：275-278.

[10] Nath P R, Isakov N. Insights into peptidyl-prolyl cis-trans isomerase structure and function in immunocytes[J]. Immunol Lett, 2015, 163(1): 120-131.

[11] Naoumov N V. Cyclophilin inhibition as potential therapy for liver diseases[J]. J Hepatol, 2014, 61(5): 1166-1174.

[12] Hamilton G. Cyclophilin A as a target of Cisplatin chemosensitizers[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2014, 14(1): 46-58.

[13] Yang Y, Lu N, Zhou J, et al. cyclophilin A up-regulates MMP-9 expression and adhesion of monocytes/macrophages via CD147 signalling pathway in rheumatoid arthritis[J]. Rheumatology (Oxford), 2008, 47(9): 1299-1310.

[14] Chukkapalli V, Randall G. Hepatitis C virus replication compartment formation: mechanism and drug target[J]. Gastroenterology, 2014, 146(5): 1164-1167.

[15] Nkongolo S, Ni Y, Lempp F A, et al. Cyclosporin A inhibits hepatitis B and hepatitis D virus entry by cyclophilin-independent interference with the NTCP receptor[J]. J Hepatol, 2014, 60(4): 723-731.

[16] Ghosh J C, Siegelin M D, Vaira V, et al. Adaptive mitochondrial reprogramming and resistance to PI3K therapy[J]. J Natl Cancer Inst, 2015,doi:10.1093/jnci/dju502.

[17] Qian Z, Zhao X, Jiang M, et al. Downregulation of cyclophilin A by siRNA diminishes non-small cell lung cancer cell growth and metastasis via the regulation of matrix metallopeptidase 9[J]. BMC Cancer, 2012, 12: 442.

[18] Aldea M, Kushner S R. Instructions for the cloning program[J]. Gene, 1988, 65(1): 117-122.

[收稿2016-01-17;修回2016-03-22]

(編輯：王靜)

Cloning and prokaryotic protein expression of humanPPIL6 gene

LiuYayan，LuoWenhui,LiangXiaohong

(Department of Dermatology, Zhuzhou Central Hospital, Zhuzhou Hunan 412007, China)

[Abstract]Objective To clone a noval human peptidylprolyl isomerase (PPIase) gene peptidylprolyl isomerase-like 6 (PPIL6) and purify the recombinant protein through prokaryotic expression and then evaluate its biochemical activity.Methods PPIL6 was cloned through PCR. Tissue distribution of PPIL6 was monitored by quantitative real-time PCR and immunohistochemistry. The cellular localization of PPIL6 was observed using EGFP fusion protein. Recombinant PPIL6 was purified from E. coli. The interaction between PPIL6 and CsA was detected by SPR. The inhibitory effects of CsA on PPIL6 was measured by spectrophotometry.Results There were two isoforms of PPIL6 (PPIL6a and PPIL6b). PPIL6 presented an isolated branch in PPIase family. PPIL6 was widely expressed in human tissues with strong staining surround kidney tubules. PPIL6 distributed in the nucleus of HeLa cells. PPIL6 bound to CsA and CsA inhibited PPIL6 activity.Conclusion A novel PPIase gene, PPIL6, is cloned and speculated to play a regulatory role in gene expression in nucleus.

[Key words]peptidylprolyl isomerase; green fluorescent protein; subcellular localization; surface plasmon resonance

[中圖法分類號]R34

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)02-0143-07