陳永正

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義　563099)

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專家論壇

生物催化還原亞胺類化合物制備手性胺的研究進(jìn)展

陳永正

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563099)

[摘要]近些年，亞胺的不對稱催化還原制備手性胺逐漸成為有機(jī)合成中的一個研究熱點，其方法主要包括金屬催化、有機(jī)小分子催化和生物催化的不對稱還原。本文著重介紹生物催化還原方法中亞胺還原酶的篩選、相關(guān)基因的克隆表達(dá)以及用于亞胺還原的人工金屬酶的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]生物催化；不對稱還原；亞胺還原酶；人工金屬酶

氨基廣泛存在于自然界各種具有生物活性的天然產(chǎn)物中，如：生物堿(嗎啡、麻黃堿)、蛋白質(zhì)、激素以及抗生素等。其中，手性胺作為一類極其重要的化合物，不僅可以作為一些藥物合成的中間體和農(nóng)用化學(xué)品的有效成份，也可以作為一些過渡金屬的配體或者直接作為有機(jī)小分子催化劑用于催化手性化合物的合成，同時還可以用于香料香精產(chǎn)業(yè)[1-2]。因此，對手性胺合成的研究受到許多化學(xué)家的高度關(guān)注，目前其合成方法主要包括化學(xué)催化合成法、生物酶催化合成法及組合催化合成法，尤其對化學(xué)催化潛手性C=N鍵的不對稱還原反應(yīng)的研究較為透徹，底物適用范圍廣泛，涵蓋N-芳基亞胺、N-烷基亞胺、烯胺等。目前使用的化學(xué)催化劑包括手性有機(jī)小分子催化劑，如手性雙烯-硼烷[3]、手性磷酸[4-6]；金屬催化劑：如銥[7-11]、鈀[12]、鈦[13]、銠[14-15]、錸[16]、釕[17]、鈷[18]。

然而，隨著制藥工業(yè)對環(huán)境以及行業(yè)規(guī)范要求的日益提高，傳統(tǒng)化學(xué)合成的方法局限性日益凸顯，生物催化的不對稱合成因具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高、綠色無污染等優(yōu)點，并且隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對酶的修飾和改性變得更加容易，逐漸被廣泛應(yīng)用于手性胺的合成中。例如Christopher K S.小組采用高活性的轉(zhuǎn)氨酶突變體催化酮到手性胺的不對稱轉(zhuǎn)化，成功實現(xiàn)了西格列汀的合成[19]；氰基還原酶作為一種新型的生物催化劑用于氰基化合物的不對稱還原，可以為手性胺的合成提供了一種新方法[20-23]。此外，利用基因工程技術(shù)對依賴于NADPH輔酶的氨基酸脫氫酶[24]與紅球菌屬中的苯丙氨酸脫氫酶[25]進(jìn)行改造，獲得的突變體酶可以催化酮的不對稱還原胺化反應(yīng)，用于合成手性胺。

在生物體中也存在亞胺還原的生化反應(yīng)過程，例如：在生物體內(nèi)存在一種“一碳單位”的接納體和供體-葉酸是一種水溶性B族維生素，廣泛存在于綠色植物、蘑菇、酵母、肝臟和腎臟中。以NADPH為輔酶，葉酸 (1-a)能在二氫葉酸(DHF)還原酶作用下，經(jīng)兩次連續(xù)還原，先后生成7,8-二氫葉酸 (1-b)和5,6,7,8-四氫葉酸 (1-c)，即輔酶F (見圖1)。

圖1　二氫葉酸還原酶反應(yīng)

此外，在生物體內(nèi)氨基酸代謝的過程中，由谷氨酸脫氫酶 (GDH)介導(dǎo)的氨基酸的氮轉(zhuǎn)移過程中可以產(chǎn)生亞胺中間體，然后經(jīng)不對稱還原得到手性α-氨基酸 (見圖2)[26]。

圖2　GDH介導(dǎo)的氨基酸代謝過程

盡管亞胺還原酶催化亞胺的不對稱還原反應(yīng)早有相關(guān)報道，但由于傳統(tǒng)亞胺化合物在水相體系中差的穩(wěn)定性，易分解生成相應(yīng)的酮和胺，而水相往往又是生物酶催化反應(yīng)的傳統(tǒng)介質(zhì)，這無疑限制了亞胺還原酶在催化亞胺不對稱還原反應(yīng)中的應(yīng)用。大多數(shù)亞胺中間體為環(huán)狀酮亞胺，并且與酮之間存在動態(tài)平衡，在酶催化作用下，平衡可以向生成新的手性氨的反應(yīng)方向移動。因此，可以用醛或酮代替亞胺，在轉(zhuǎn)氨酶催化作用下，實現(xiàn)手性胺的高對映選擇性合成，從而克服以亞胺作底物在水溶液中不穩(wěn)定的局限性。下面將重點對生物催化亞胺合成手性胺化合物的方法進(jìn)行討論。

1亞胺還原酶

2004年，Stephens G.小組以正丁醛、苯甲醛、正丁胺和苯胺作為底物，采用動態(tài)組合篩選的方法，以水和正十四烷作為兩相反應(yīng)體系，成功篩選出亞胺還原酶產(chǎn)生菌株Acetobacteriumwoodii。在篩選過程中他們發(fā)現(xiàn)，用咖啡酸酯誘導(dǎo)后的菌株在催化N-亞芐基苯胺和N-亞丁基苯胺的還原反應(yīng)中，能夠顯示出高的催化活性；而不經(jīng)誘導(dǎo)的菌株只能用于N-亞丁基苯胺和苯甲醛的還原，對其他底物的還原沒有催化活性 (見圖3)[27]。

圖3　動態(tài)組合法在亞胺還原酶篩選中的應(yīng)用

2008年，Chadha A.小組以芳香亞胺為底物，采用CandidaparapsilosisATCC 7330整細(xì)胞生物催化劑，實現(xiàn)了水相體系中亞胺的不對稱還原反應(yīng)，獲得了R構(gòu)型的芳香仲胺。研究過程中，他們發(fā)現(xiàn)苯環(huán)上連有吸電子基團(tuán)或供電子基團(tuán)對反應(yīng)結(jié)果影響不大，對映選擇性為95%～99%，產(chǎn)率為55%～80% (見圖4)[28]。

圖4　ATCC 7330催化芳香亞胺合成手性仲胺

2010年，Mitsukura K.小組以2-甲基-1-二氫吡咯 (2-MPN)為底物，從226株酵母菌、261株細(xì)菌、117株放線菌和84株真菌中篩選獲得了五株具有亞胺還原活性的放線菌屬微生物。用其中一株催化2-MPN的不對稱還原，可以得到S構(gòu)型的產(chǎn)物，而用另外四株催化該反應(yīng)，則得到R構(gòu)型的產(chǎn)物。值得注意的是，這些菌株具有較好的底物耐受性，即使在27.5～91 mmol/L的底物濃度下，產(chǎn)物的收率和ee值也可分別達(dá)到92%和99.2% (見圖5)[29-30]。

圖5　亞胺還原酶催化2-MPN的不對稱還原

隨后，他們克隆表達(dá)了菌株中的亞胺還原酶基因，發(fā)現(xiàn)對R/S選擇性的亞胺還原酶均依賴輔酶NADPH，且均為同源二聚體結(jié)構(gòu)，亞基大小分別為32 kDa、30.5 kDa。更有趣的是，在中性pH條件下，具有R選擇性的還原酶對2-MPN表現(xiàn)出還原活性，在堿性條件下，則對 (R)-2-MP表現(xiàn)出氧化活性。此外，通過對兩種不同選擇性的亞胺還原酶進(jìn)行氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)S選擇性的亞胺還原酶與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶具有60%的相似度，而R選擇性的亞胺還原酶與6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的相似度只有37%[31]。

同年，Santos L S.小組采用Saccharomycesbayanus整細(xì)胞催化的方法，實現(xiàn)了β-咔啉亞胺類化合物的不對稱還原，實驗結(jié)果表明，R取代基對反應(yīng)的選擇性有著很大的影響。當(dāng)R為C1-C11的脂肪族取代基時，該酶顯示出S選擇活性，當(dāng)R取代基碳鏈長度增加到C15以上或者為芳香取代基團(tuán)時，則酶顯示出R選擇活性[32]。在研究過程中，他們還發(fā)現(xiàn)蚯蚓細(xì)胞的提取液也可以用于β-咔啉亞胺的不對稱還原反應(yīng)。與之前不同的是，該生物催化劑只是顯示出R選擇性，產(chǎn)物ee值為85%～99% (見圖6)[33]。

圖6　整細(xì)胞催化β-咔啉亞胺類化合物不對稱還原

2012年，Lamb A. L.小組從Yersiniaenterocolitica中分離得到依賴NADPH的亞胺還原酶，在噬鐵耶爾森桿菌素形成過程中用于介導(dǎo)二氫噻唑的還原。通過將分離獲得的亞胺還原酶與載脂蛋白及NADP+結(jié)合得到的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定，分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)與葡萄糖-果糖氧化還原酶、1,5-果糖苷還原酶以及膽綠素還原酶的結(jié)構(gòu)類似。此外，他們還發(fā)現(xiàn)該酶的C端區(qū)域存在大量的特有的環(huán)狀片段，這些特殊片段與來自Pseudomonasaeruginosa的噻唑啉亞胺還原酶的具有較高同源性，該結(jié)構(gòu)域并不存在于其他結(jié)構(gòu)類似物中，因此，他們認(rèn)為該環(huán)狀區(qū)域在底物識別過程中起著至關(guān)重要的作用。并且還對該結(jié)構(gòu)作了進(jìn)一步的解析，初步確定101號位的組氨酸和128號位酪氨酸以及NADPH分別在催化C=N雙鍵還原的過程中起到提供質(zhì)子的作用[34]。

2013年，Grogen G.小組用從Streptomyceskanamyceticus中獲得的氧化還原酶(Q1EQE0)，實現(xiàn)了單環(huán)亞胺2-甲基-1-二氫吡咯啉的不對稱還原反應(yīng)。Q1EQE0的分子量大小為32 kDa，在以NADPH作為輔酶的情況下，Km值達(dá)到8.21±1.07 mM，kcat值達(dá)到 (0.018±1.4)×10-3s-1，對映選擇性大于99%。另外，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到30 mM以上時，反應(yīng)表現(xiàn)出明顯的底物抑制現(xiàn)象，經(jīng)計算Ki為56.5±10.7 mM。當(dāng)向反應(yīng)體系中加入NADH時，則酶沒有催化活性，此結(jié)果表明該酶對NADPH有著嚴(yán)格的依賴性。通過對其結(jié)構(gòu)分析，他們發(fā)現(xiàn)Q1EQE0是以二聚體的形式催化反應(yīng)的，其每個單體由28個氨基酸組成，其中187號天冬氨酸殘基在酶的催化活性中起到關(guān)鍵性作用[35]。

2014年，H?hne M.小組分別從類芽孢桿菌PaenibacilluselgiiB69、鏈霉菌Streptomycesipomoeae91-03、假單胞菌PseudomonasputidaKT2440中克隆表達(dá)出三種亞胺還原酶，其中從假單胞菌中克隆獲得的亞胺還原酶顯示出最好的催化活性。進(jìn)一步的基因突變證明該酶起催化作用的殘基為組氨酸殘基，有別于已報道的克隆于Streptomyceskanamyceticus的還原酶，后者起催化作用的是天冬氨酸殘基 (見圖7)[36]。

圖7　還原酶催化合成光學(xué)純的二次循環(huán)胺亞胺

同年，Hauer B.小組通過將已報道的亞胺還原酶基因的序列于已獲得的亞胺還原酶序列進(jìn)行比對分析，分別篩選出了具有R選擇性和S選擇性的亞胺還原酶的基因序列。通過進(jìn)一步克隆表達(dá)、蛋白純化獲得了純酶催化劑，并以此催化2-甲基-二氫吡咯的不對稱還原反應(yīng)。研究表明，與之前報道的亞胺還原酶相比，這些酶可以表現(xiàn)出更好的催化活性，而且活性中心的氨基酸殘基對還原活性的維持起著至關(guān)重要的作用[37]。

2人工金屬酶

除了上述的亞胺還原酶外，人工金屬酶也被廣泛應(yīng)用于亞胺的不對稱還原反應(yīng)，這類催化劑主要是利用肽支架與化學(xué)催化劑的中心結(jié)合，以達(dá)到改變反應(yīng)的微環(huán)境的目的，實現(xiàn)對反應(yīng)選擇性的控制。

2011年，Ward T. R.小組利用生物素衍生的雙胺配體/金屬配合物與野生型鏈霉親和素蛋白協(xié)同催化6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉的不對稱還原反應(yīng)，得到了R構(gòu)型的豬毛菜定[38]。后來，他們采用相同的技術(shù)得到了人造轉(zhuǎn)移氫化酶，并將其用于生物催化的氧化還原級聯(lián)反應(yīng)。通過將此酶分別與NADH依賴、FAD依賴和血紅素依賴的酶結(jié)合，以此考察酶的催化效率，用于證明該方法的普適性[39]。進(jìn)一步將酶活性部位插入疏水性氨基酸殘基，得到新的人工金屬酶[40]，其催化效率大大提高，較野生型亞胺還原酶的催化效率提高7倍，反應(yīng)的對映選擇性也得到了提高，并且還很好地克服了底物抑制的局限性。即使將底物濃度提高到150 mmol/L，反應(yīng)的Kcat也能達(dá)到20 min-1。

在前期的工作基礎(chǔ)上，他們通過基因工程技術(shù)對宿主蛋白周圍的基因進(jìn)一步修飾，篩選獲得的氫化酶 (ATHase)，能夠高效催化6,7-二甲氧基-1-甲基-3,4-二氫異喹啉的不對稱轉(zhuǎn)移氫化反應(yīng)，得到不同構(gòu)型的還原產(chǎn)物。進(jìn)一步研究證明，金屬銥和鏈霉親和素蛋白的結(jié)合比例可以在很大程度上影響亞胺還原酶的動力學(xué)參數(shù)及其催化反應(yīng)的對映選擇性。通過計算機(jī)輔助計算和X射線衍射技術(shù)分析有機(jī)金屬與生物支架的對接情況，并結(jié)合飽和動力學(xué)研究，他們提出了高對映選擇性“誘導(dǎo)鎖鑰”假說，即宿主蛋白的結(jié)構(gòu)決定了金屬銥輔因子的組態(tài)，該組態(tài)又在很大程度上決定了亞胺還原酶的選擇性。更值得一提的是，人工金屬酶被證明具有野生酶的原始活性，其不僅可以彌補野生酶的不足，還可用于催化串聯(lián)反應(yīng) (見圖8)[41-42]。

圖8　人工亞胺還原酶催化的不對稱轉(zhuǎn)移氫化

3展望

本文對亞胺還原酶制備手性胺的應(yīng)用研究進(jìn)行了簡要的概述，重點探討了幾個課題組將生物催化法用于亞胺的不對稱還原制備光學(xué)純仲胺的研究進(jìn)展。綜觀此領(lǐng)域的研究不難發(fā)現(xiàn)，目前采用亞胺還原酶合成手性胺的報道仍然較少，其主要歸結(jié)于亞胺還原酶的類型及其催化反應(yīng)底物的普適性仍有較大的局限性。近來，對生物體中的代謝過程已經(jīng)有了比較深入的研究，并且最新發(fā)現(xiàn)的幾個氧化還原酶可以在非水介質(zhì)中進(jìn)行有效的生物催化反應(yīng)[43]，這一發(fā)現(xiàn)為實現(xiàn)非水介質(zhì)中的生物催化亞胺還原合成手性胺提供了可行性參考。因此，如何更好的利用這些最新研究成果，深入開發(fā)豐富微生物資源中的亞胺還原酶，并進(jìn)一步運用分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)對亞胺還原酶進(jìn)行改造，對于豐富亞胺還原酶的種類和構(gòu)建一些新型的化學(xué)合成反應(yīng)，實現(xiàn)更廣泛的亞胺底物的不對稱還原，仍然是一項具有一定挑戰(zhàn)性且極有意義的工作，也將會受到越來越多的關(guān)注。

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[收稿2016-02-12;修回2016-03-15]

(編輯：譚秀榮)

Advances in bioreduction of imines to chiral amines

ChenYongzheng

(School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099,China)

[Abstract]Recently, catalytic asymmetric reduction of imines to chiral amines, mainly including metal catalysis, organocatalysis and biocatalysis, has increasingly become a hot topic in organic chemistry. In this review, we focused on recent progress of the bioreduction of imines to chiral amines involving the screening of imine reductase, related genes cloning and expression as well as the artificial metalloenzyme used for the reduction of imines.

[Key words]biocatalysis; asymmetric reduction; imine reductase; artificial metalloenzyme

[中圖法分類號]Q814

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)02-0107-07

[通信作者]陳永正，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師。主要從事微生物酶的篩選、發(fā)現(xiàn)和在手性藥物合成中的應(yīng)用研究，探索化學(xué)藥物的綠色制造和環(huán)境友好合成技術(shù)。教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃獲得者、第二批貴州省高層次創(chuàng)新型人才“百”層次入選者、第九批貴州省優(yōu)秀青年科技人才培養(yǎng)對象、第七批貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊領(lǐng)銜人、第一批貴州省教育廳優(yōu)秀科研創(chuàng)新團(tuán)隊領(lǐng)銜人、貴州省藥學(xué)特色重點學(xué)科手性藥物的化學(xué)生物學(xué)方向帶頭人、貴州省仿制藥物工程研究中心負(fù)責(zé)人?，F(xiàn)受邀為Organic Letters等12種SCI期刊雜志評議人。主持國家自然科學(xué)基金項目3項，在國際知名SCI期刊Angew Chem Int Ed，Adv Synth Catal和J Org Chem等雜志上發(fā)表論文18篇，其中2篇論文被著名評論期刊SYNFACTS作為亮點工作進(jìn)行評價。E-mail：yzchen@zmc.edu.cn。

[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(NO:21162047);貴州省科技廳基金資助項目(NO:QKHGZ-2011-7017)。