謝瑞芳 林評蘭 王瑛 周昕

摘要：目的 研究不同配伍比例對當歸補血湯化學成分和促血管新生作用的影響。方法 采用高效液相色譜法測定不同配伍比例當歸補血湯中的主要化學成分阿魏酸、毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量；采用轉基因斑馬魚模型比較不同配伍比例當歸補血湯的促血管新生作用。結果 隨著黃芪含量的增加，不同配伍比例煎液指標成分綜合得分有上升趨勢，且在黃芪與當歸之比為8∶2與5∶1時綜合得分最高。對于斑馬魚血管損傷模型，血管恢復率排名前3位的配比分別是黃芪與當歸之比為5∶1、6∶1和2∶1。結論 從化學成分及促血管新生療效綜合分析，黃芪與當歸經(jīng)典配伍比例（5∶1）好于其他比例。

關鍵詞：當歸補血湯；化學成分；斑馬魚；促血管新生

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.022

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）06-0083-05

Abstract： Objective To study chemical ingredients and angiogenesis effects for different compatibility proportions of Danggui Buxue Decoction. Methods For chemical components， HPLC was performed to study the ingredients （Ferulic Acid， Calycosin-7-glusosido， Calycosin， Formononetin） in Danggui Buxue Decoction. For angiogenesis effects， transgenosis zebrafish model was incubated with different proportions of Danggui Buxue Decoction. Results With the raise of Astragali Radix content， the synthetic scores of four ingredients in different compatibility proportions increased. When the Astragali Radix content to Angelicae Sinensis Radix content was 8 to 2 and 5 to 1， the scores were the highest. For zebrafish vascular injury model， vessel recoveries in top three were 5：1， 6：1 and 2：1 （Astragali Radix： Angelicae Sinensis Radix）. Conclusion From comprehensive analysis of chemical composition and angiogenesis， the best compatibility ratio of Astragali Radix to Angelicae Sinensis Radix is 5：1.

Key words： Danggui Buxue Decoction； chemical components； zebrafish； angiogenesis

當歸補血湯為補血的代表方劑，由黃芪和當歸2味藥組成，用于治療血虛發(fā)熱證，亦治婦人經(jīng)期、產(chǎn)后血虛發(fā)熱頭痛，或瘡瘍潰后、久不愈合等[1]。藥理研究表明，當歸補血湯具有保護心肌缺血再灌注引起的心功能減弱、促進造血、改善血液黏度等作用[2-4]，臨床資料顯示其對冠心病、心絞痛等心血管疾病具有很好的療效[5-6]。歷代醫(yī)家對當歸補血湯證的病機、主治及用藥法度皆有爭議?；蛟茷闅馓摱O，君黃芪補氣為主；或云為血虛而設，君當歸補血為主；也有說為氣血兼治，用于氣血兩虛證的治療[7]。因此，當歸補血湯中2味中藥的用藥劑量在中醫(yī)古籍中有許多種用法，而藥物劑量的變化直接影響有效成分含量和治療作用。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）測定4種指標成分含量，采用轉基因斑馬魚血管損傷模型，比較不同配伍比例當歸補血湯的化學成分與促血管新生的治療作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1 儀器、試藥與動物

Agilent 1290高效液相色譜儀，美國惠普公司；愛生牌斑馬魚獨立養(yǎng)殖單元（5層雙排），北京愛生科技發(fā)展有限公司；SMZ745體視顯微鏡，Nikon；SMZ18熒光體視顯微鏡，Nikon；LQ-C3003電子天平，瑞安市安特重設備；XW-80渦旋混合器，上海醫(yī)科大學儀器廠；SB2200超聲儀，上海醫(yī)用分析儀器廠；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；TGL-16G臺式高速離心機，上海醫(yī)用分析儀器廠；pH計（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

Krebs液（NaCl 119，KCl 4.7，MgCl2·6H2O 1，NaHCO3 25，KH2PO4 1.2， D-glucose 11.1，CaCl2 2.5）；60 mmol/L KCl Krebs液（NaCl 63，KCl 60，MgCl2·6H2O 1，NaHCO3 25，KH2PO4 1.2，D-glucose 11.1，CaCl2 2.5）；溶血磷脂酰膽堿（LPC，美國Sigma公司，SLBH3673V）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma，SHBC3313V）；內皮細胞生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（VRI，Sigma），溶解于DMSO配制為100 mmol/L儲備液，-20 ℃儲存。

黃芪（甘肅，上海萬仕誠國藥制品有限公司，批號140922-1）；當歸（甘肅，上海萬仕誠國藥制品有限公司，批號140924-1）；阿魏酸（成都曼斯特生物有限公司，純度98.6%，批號MUST-13112204）；毛蕊異黃酮苷（批號05-1021）、毛蕊異黃酮（批號05-2027）、刺芒柄花素（批號05-2014），上海中藥標準化研究中心。

轉基因斑馬魚Tg（fli1a-EGFP），上海中醫(yī)藥大學附屬龍華醫(yī)院斑馬魚實驗室提供，依據(jù)zebrafish handbook方法飼養(yǎng)。

2 化學成分含量測定

2.1 溶液的制備

2.1.1 藥液的煎煮 分別稱取相應比例當歸補血湯藥材約100 g（黃芪與當歸比例為1∶5、5∶6、1∶1、2∶1、5∶2、10∶3、8∶2、5∶1、6∶1），加8倍量水，浸泡30 min，沸后加熱20 min，煎煮3次，合并藥液，濃縮至1 g原藥材/mL，得到當歸補血湯及其藥材水煎液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取上述水煎液1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇接近刻度，搖勻，超聲20 min，冷卻至室溫，補充甲醇至刻度，搖勻，靜置過夜，取上清液10 000 r/min離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取阿魏酸4.40 mg置于10 mL量瓶中，毛蕊異黃酮苷5.20 mg、毛蕊異黃酮2.20 mg、芒柄花素5.20 mg，分別置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，稀釋至不同濃度，用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為對照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Zorbax RRHD SB-C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）；檢測波長：254 nm（毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、刺芒柄花素）、316 nm（阿魏酸）；進樣量：2 μL；檢測時間：15 min；流動相：乙腈-0.2%磷酸水，等度洗脫（阿魏酸、毛蕊異黃酮苷，10.0%乙腈；毛蕊異黃酮、刺芒柄花素，25.0%乙腈）；流速：0.25 mL/min；柱溫：35 ℃。結果表明，在此條件下，各指標成分的色譜峰與雜質能夠達到基線分離，峰型對稱，分離較好且保留時間適中。色譜圖見圖1。

2.3 標準曲線的繪制

精密吸取阿魏酸、毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷和芒柄花素不同濃度的對照品溶液注入色譜儀，進樣量為2 μL，按“2.2”項下色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標，對照品含量為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，各指標成分在相應范圍內，相關系數(shù)均>0.999 5，線性關系良好，見表1。

2.4 指標成分含量結果

為控制所用黃芪及當歸藥材的質量，測量當歸中的阿魏酸及黃芪中毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素含量。結果表明，阿魏酸含量在復方中高于當歸藥材，且隨黃芪在復方中所占比例上升，含量更高，可能黃芪有助于阿魏酸的溶出；毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素3個成分含量在復方中除1∶5比例者偏低，其他比例中差異不大，其中毛蕊異黃酮苷含量在復方中基本高于黃芪藥材。結果見表2。

2.5 不同配伍比例藥材含量的綜合評分

為了綜合評價各藥材配伍比例當歸補血湯有效成分的溶出度，采用AHP法根據(jù)當歸補血湯中有效成分HPLC檢測信息，將其316 nm波長處阿魏酸色譜峰及254 nm波長處毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮、刺芒柄花素的色譜峰作為相同權重的評分指標，計算每種配伍的綜合得分，得分越高的配伍可認為化合物成分溶出度越高。

根據(jù)測定的HPLC含量信息，將9種配伍比例所含的每種指標成分含量從小到大依次排列，給予分數(shù)，再將復方中的各成分得分按各占25%的權重相加，得到綜合評分。指標成分評分（%）=（成分含量-該成分含量最小值）÷（該成分含量最大值-該成分含量最小值）×100%。結果表明，黃芪與當歸配伍比例為8∶2及經(jīng)典配伍比例（5∶1），綜合評分較高，見表3。

3 促血管新生作用研究

3.1 斑馬魚毒性實驗

選擇發(fā)育正常，受精24 h（24 hpf）的轉基因斑馬魚Tg（fli-1a：EGFP）胚胎，用鑷子去掉卵殼，將其放入含有embryo medium的12孔板中（每孔10條）。按實驗分組加入相應濃度的藥物，放入28.5 ℃的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)至48 hpf時，用embryo medium清洗12孔板中的各個組，重新加入embryo medium和不同濃度的藥物，操作同第1日。在培養(yǎng)至48 hpf和72 hpf時，觀察不同濃度的各藥物組斑馬魚的死亡情況和致畸形情況，記錄各藥物組斑馬魚能耐受的最大劑量，為下一步實驗劑量的確定提供依據(jù)。

3.2 藥物分組

分為空白對照組、VRI血管損傷模型組、不同配伍比例當歸補血湯給藥組（1∶5，5∶1，1∶1，2∶1，5∶2，5∶6，6∶1，10∶3，8∶2）。

3.3 斑馬魚節(jié)間血管恢復實驗

在VRI誘導血管損失模型中，將從背主動脈（DA）或者脊椎主靜脈（PCV）發(fā)芽延伸并連接到背部脊索血管（DLAVs）的體節(jié)間靜脈（ISVs）定義為完整血管（intact），而一些已經(jīng)從DA或者PCV延伸出但并未與DLAVs相連的ISVs定義為缺陷型血管（defective）。

選擇發(fā)育正常，24 hpf的轉基因斑馬魚Tg（fli-1a：EGFP）胚胎，用鑷子去掉卵殼，將其放入含有embryo medium的12孔板中（每孔10個）。模型組和給藥組先加入VRI 100 nmol/L在28.5 ℃培養(yǎng)箱中處理3 h，然后加embryo medium清洗3遍，模型組加入embryo medium，藥物組則加入相應的藥物，放入28.5 ℃飼養(yǎng)箱里，培養(yǎng)至48 hpf時，在熒光顯微鏡下拍照，觀察不同藥物對斑馬魚節(jié)間血管的影響。分別對每條斑馬魚的完整血管和缺陷型血管進行統(tǒng)計，研究藥物對斑馬魚節(jié)間血管的恢復作用。

統(tǒng)計每組加藥濃度的節(jié)間血管指數(shù)（完整血管數(shù)+0.5×缺陷型血管數(shù)），根據(jù)血管指數(shù)計算VRI誘導斑馬魚血管損傷模型給藥后的血管恢復率[（該組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù)）÷（空白對照組血管指數(shù)-VRI組血管指數(shù)）×100%]，每組實驗至少重復3次。

3.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)以 —x±s表示。采用GraphPad Prism 6軟件繪圖。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3.5 結果

3.5.1 正常斑馬魚毒性實驗結果 以當歸和黃芪1∶5比例組成的當歸補血湯，進行斑馬魚藥物毒性篩選，觀察斑馬魚給藥24、48 h后致死情況，從而得到藥物最大安全濃度，為進一步研究提供劑量依據(jù)。結果表明，當歸補血湯最大安全濃度為250 μg/mL。

3.5.2 不同配比的當歸補血湯對血管損傷斑馬魚模型的保護作用 將不同配伍比例的當歸補血湯煎液均稀釋至濃度為200 μg/mL，并以該濃度給藥48 h，比較各比例當歸補血湯對VRI誘導的損傷斑馬魚節(jié)間血管的作用。各組斑馬魚血管生成圖見圖2、血管數(shù)量見圖3。結果表明：①各配伍比例當歸補血湯加藥組中，在處理48 h后均有明顯的對VRI誘導血管損傷斑馬魚的保護效果，與模型組比較有明顯差異，說明各配伍比例的當歸補血湯對VRI損傷的斑馬魚節(jié)間血管均有促血管新生作用。②各配伍比例當歸補血湯加藥組中，每組對VRI誘導血管損傷斑馬魚修復效果不同。對3次實驗各組血管恢復率均值進行排序，結果血管恢復率排名前3位的配伍比例分別是黃芪與當歸比例為5∶1、6∶1和2∶1。

4 討論

中醫(yī)學經(jīng)典理論雖未直接提出血管新生的概念，但有許多相關認識。血管概念包括在“脈”“血脈”“血絡”含義中，其中“脈”包含解刨學較大“血管”，而“血絡”則特指微血管，為“脈”細小分支與延續(xù)。脈絡生成與功能和五臟均有聯(lián)系，其“資始于腎”，“資生于胃”，“統(tǒng)于心”，“會于肺”，“約于肝”[8]。從補腎益精、補益心氣、調肝理氣、活血化瘀、養(yǎng)血生脈的角度，探索中藥的促血管生成作用，是一個較為有意義的研究方向。

斑馬魚是目前生命科學研究中中藥的模式脊椎動物之一，作為一種新的模式生物[9]，既有與哺乳動物類似的生理、生化特征，又具有高效、快速、大規(guī)模的特點。近年來，轉基因斑馬魚已成為血管新生研究的重要模型之一，可觀測斑馬魚的血管系統(tǒng)內皮細胞上有綠色熒光蛋白的表達，直接觀察藥物對血管的效應。斑馬魚的血管發(fā)生為：大的軸向血管（背動脈和尾部靜脈）和尾部靜脈簇的發(fā)生方式是血管形成，其他血管的發(fā)生方式是血管新生[10-11]。斑馬魚血管發(fā)生過程很快，受精后不久，胚胎心臟開始有規(guī)律的跳動，背動脈和尾部靜脈內出現(xiàn)血細胞流動，體節(jié)間血管開始向背部生長。用VRI抑制血管新生造成血管損傷模型，不僅靶點清晰，而且針對性強[12]。因此，本研究采用VRI抑制斑馬魚血管生成模型研究不同配伍比例對血管新生的影響。結果表明，復方療效好于單味，且血管恢復率排名前3位的配比分別是黃芪與當歸為5∶1、6∶1和2∶1。

此外，本研究比較了不同配伍比例的當歸補血湯的化學成分，結果表明，隨著黃芪含量的增加，不同配比煎液指標成分綜合得分有著上升趨勢，并在黃芪當歸之比8∶2、5∶1時綜合得分最高。

由此可見，當歸補血湯經(jīng)典配伍比例（黃芪∶當歸=5∶1）無論是有效成分的含量還是促血管新生的療效，都比其他配伍比例好。本研究為當歸補血湯的配伍理論提供了一定的依據(jù)。

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（收稿日期：2015-07-10）

（修回日期：2015-07-29；編輯：陳靜）