張靜 丁博 祁俊生 陳秀紅 周濃

摘要：目的 建立高效液相色譜法測(cè)定重樓中薯蕷皂苷元含量，考察不同產(chǎn)地和不同品種重樓屬藥用植物中薯蕷皂苷元的含量。方法 采用島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），以乙腈-水（92∶8）為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果 不同產(chǎn)地、不同品種的重樓屬藥材中均含有薯蕷皂苷元，渝北區(qū)的長(zhǎng)藥隔重樓含量最高（6.813 7 mg/g），城口縣的狹葉重樓含量次之（5.758 4 mg/g），最低的為石柱縣的滇重樓（1.952 2 mg/g），表明不同栽培品種重樓藥材化學(xué)品質(zhì)差異較大，可能與產(chǎn)地、品種及栽培技術(shù)等因素有關(guān)。結(jié)論 非藥典品種長(zhǎng)藥隔重樓、狹葉重樓含量超過(guò)中國(guó)藥典收載品種，具有較大的藥用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：重樓；薯蕷皂苷元；高效液相色譜法；質(zhì)量評(píng)價(jià)

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.021

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）06-0080-04

Abstract： Objective To establish an HPLC method to determine the content of diosgenin in Paridis Rhizoma； To examine contents of diosgenin in different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and from different habitats. Methods Shimadzu Inertsil ODS-C18 guard column （150 mm×4.6 mm， 5?m） was used in HPLC system； elution conditions were the mobile phase using 92% acetonitrile and 8% water （isocraticelution） at a flow rate of 1.0 mL/min with 203 nm detection wavelength. The temperature of the column oven was maintained at 30 ℃. Results Different varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants and Paridis Rhizoma medicinal plants from different habitats contained diosgenin. The Paris polyphylla var. pseudothibetica in Yubei district had the highest content （6.813 7 mg/g）； Paris polyphylla var. stenophylla in Chengkou County had the middle content （5.758 4 mg/g）； Paris yunnanensis Franch in Shizhu county showed the lowest content （1.952 2 mg/g）. The results showed that the obvious difference of chemical quality between various cultivated varieties of Paridis Rhizoma medicinal plants， which might be related with origin， variety and the cultivation technology， and so on. Conclusion The diosgenin contents of Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla were higher than that of varieties recorded in Chinese Pharmacopeia. Paris polyphylla var. pseudothibetica and Paris polyphylla var. stenophylla had important medical value.

Key words： Paridis Rhizoma； diosgenin； HPLC； quality evaluation

重樓主要活性成分為薯蕷皂苷和偏諾皂苷等類(lèi)型，薯蕷皂苷通過(guò)水解可以得到薯蕷皂苷元[1-2]。薯蕷皂苷元是合成甾體激素類(lèi)藥物的重要原料，具有抗腫瘤、抗炎、心血管保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種生物活性，為重樓藥材生物活性的物質(zhì)基礎(chǔ)[3]。三峽地區(qū)為重樓屬藥用植物的地理分布中心之一，藥材品種較為豐富[4-5]，但存在種質(zhì)來(lái)源復(fù)雜、分類(lèi)不明等嚴(yán)重問(wèn)題，導(dǎo)致其開(kāi)發(fā)利用率較低。目前，已有對(duì)滇重樓[6]、七葉一枝花[7]、北重樓[8]等重樓藥材中薯蕷皂苷元含量測(cè)定的報(bào)道。本試驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定重樓藥材中薯蕷皂苷元含量，并對(duì)比三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地、不同品種重樓藥材質(zhì)量，以期為三峽庫(kù)區(qū)重樓藥材資源的合理開(kāi)發(fā)與利用提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司），DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），RV 10 basic V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)IKA集團(tuán)），CP225D型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

重樓新鮮根莖采自重慶市開(kāi)縣滿月鄉(xiāng)雙坪村1組等地，每份樣品均取10株成熟植株根莖以保證樣品代表性，并由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員鑒定（見(jiàn)表1）。薯蕷皂苷元對(duì)照品（批號(hào)111539- 200001，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用）。色譜純乙腈為德國(guó)默克公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

島津Inertsil ODS-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 ?m），流動(dòng)相為乙腈-水（92∶8），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 ?L，采集時(shí)間10 min，理論板數(shù)以薯蕷皂苷元峰面積計(jì)不得低于4000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含0.539 0 mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

參照周氏等[6]方法略作修改。精密稱(chēng)取本品粉末（過(guò)三號(hào)篩）約0.20 g，置250 mL具塞三角瓶中，加入石油醚（60～90 ℃）50 mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）2 h，棄石油醚，殘?jiān)尤爰状?5 mL，超聲提?。?00 W，40 kHz）40 min，放冷，過(guò)濾，重復(fù)操作1次，合并濾液，減壓回收甲醇至干，加2 mol/L鹽酸10 mL，置沸水浴中水解2.5 h，放冷，置分液漏斗中，加入石油醚（60～90 ℃）萃取3次，每次30 mL，合并石油醚萃取液，水洗至中性，減壓回收石油醚至干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品貯備溶液，采用逐級(jí)稀釋法分別制得薯蕷皂苷元的0.027 0、0.053 9、0.134 8、0.269 5、0.404 3、0.539 0 mg/mL對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液。分別精密吸取對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)液20 μL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量（μg）與峰面積的線性方程。結(jié)果表明，薯蕷皂苷元在0.54～10.78 μg線性范圍內(nèi)其進(jìn)樣量與峰面積具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=631 205X+52 970，r=0.999 8（n=6）。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S3），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得薯蕷皂苷元峰面積的RSD=0.35 %，表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（S3），室溫密閉放置，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件在0～24 h每隔4 h測(cè)定1次，結(jié)果薯蕷皂苷元峰面積RSD=1.89%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一重樓樣品6份（S3），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果薯蕷皂苷元的平均含量為2.539 5mg/g，RSD=1.61%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

稱(chēng)取已知含量的重樓藥材粉末約0.10 g（S3），共6份，分別精密加入薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明，薯蕷皂苷元平均回收率為96.81%，RSD=1.48%，符合分析要求（見(jiàn)表2）。

2.9 樣品測(cè)定

分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣前過(guò)0.22 ?m微孔濾膜，進(jìn)樣20 ?L，進(jìn)行HPLC分析，測(cè)定峰面積，以外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算各重樓中薯蕷皂苷元的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

對(duì)不同流動(dòng)相體系、檢測(cè)波長(zhǎng)和供試品溶液的制備方法[6-8]進(jìn)行了綜合考察，結(jié)果表明，以乙腈-水（92∶8）的流動(dòng)相體系等度洗脫所得色譜峰分離效果最佳；檢測(cè)波長(zhǎng)在203 nm處薯蕷皂苷元有最大吸收；甲醇為提取溶劑，超聲提取40 min，超聲提取2次，酸水解、有機(jī)溶劑萃取即可將重樓中的薯蕷皂苷元基本提取完全。

本研究結(jié)果表明，三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地的重樓藥材普遍含有薯蕷皂苷元，但同一品種的不同產(chǎn)地重樓藥材中薯蕷皂苷元含量存在較大差異，其中以重慶市城口縣與重慶市石柱縣產(chǎn)狹葉重樓中薯蕷皂苷元含量相差近2倍，重慶石柱縣與重慶市萬(wàn)州區(qū)產(chǎn)滇重樓中薯蕷皂苷元含量也相差近2倍，但3個(gè)不同產(chǎn)地的七葉一枝花含量相差甚微，與付氏等[11]報(bào)道類(lèi)似。造成三峽庫(kù)區(qū)不同產(chǎn)地重樓薯蕷皂苷元含量差異的原因，可能與栽培技術(shù)、產(chǎn)地環(huán)境等有關(guān)[9-11]，表明需加大對(duì)重樓的人工栽培技術(shù)和產(chǎn)地適宜性研究，以確保重樓藥材資源可持續(xù)利用和重樓醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。

除2個(gè)中國(guó)藥典法定品種（七葉一枝花和滇重樓）外，筆者還采集到其他5個(gè)種/變種，試驗(yàn)結(jié)果表明，重樓屬不同種植物的薯蕷皂苷元含量存在較大差異（1.952 2～6.813 7 mg/g），渝北區(qū)的長(zhǎng)藥隔重樓含量最高，城口縣的狹葉重樓含量次之，最低的為石柱縣的滇重樓。不同品種間薯蕷皂苷元含量差異較大，非藥典品種能否代替重樓入藥有待進(jìn)一步深入研究。

前期研究表明，重樓屬植物大部分品種均在入藥，且部分品種與中國(guó)藥典收載品種（滇重樓和七葉一枝花）具有一定的化學(xué)成分等同性[4，11-12]。本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，不同品種重樓藥材中薯蕷皂苷元含量差別很大，而民間有代用的習(xí)慣，因此制定其含量標(biāo)準(zhǔn)是很有科學(xué)意義的。

致謝：中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所李恒研究員在植物標(biāo)本鑒定中給予的幫助。

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（收稿日期：2015-07-02）

（修回日期：2015-07-21；編輯：陳靜）