朱貝貝 劉萍萍 李淑玲 劉凱 李應(yīng)東

摘要：目的 觀察當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對(duì)過氧化氫（H2O2）致PC12細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。方法 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，構(gòu)建氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組及中藥低、中、高劑量組，中藥各組給予不同劑量當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化，Western blot檢測Bax、Bcl-2和cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，中藥各劑量組細(xì)胞凋亡率明顯降低，線粒體膜電位升高，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)均減弱，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05）。結(jié)論 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物具有抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡的作用。

關(guān)鍵詞：當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物；過氧化氫；PC12細(xì)胞；凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.018

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）06-0068-05

Abstract： Objective To observe the effects of ultrafiltration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix on PC12 cell apoptosis induced by H2O2； To discuss its mechanism of action. Methods H2O2 was used in the incubation of PC12 cells to establish the oxidative damage nerve cell apoptosis model. The experiment was divided into normal control group， model group， and three different dosages （0.375， 0.75， 1.5 g/L） of ultra-filtration extracted from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix after modeling for interference. Rate of cell apoptosis was detected by flow cytometry； mitochondrial membrane potential was measured by laser scanning confocal microscopy； the protein expressions of cleaved Caspase-3， Bax and Bcl-2 were detected by Western blot. Results Compared with the model group， rates of cell apoptosis in the different dosage groups decreased significantly； membrane potential of mitochondria increased； the protein expressions of cleaved Caspase-3 and Bax decreased； the expression of Bcl-2 increased； the ratio of Bcl-2 and Bax increased （P<0.05）. Conclusion The ultra-filtration extracted from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix can inhibit PC12 cell apoptosis induced by H2O2.

Key words： ultra-filtration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix； H2O2； PC12 cells； apoptosis

當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物（ultra-filtration extract from Angelica Sinensis Radix and Hedysari Radix，UFE-AH）具有抗自由基、抗氧化損傷等功效[1-4]。過氧化氫（H2O2）是活性氧族（ROS）的主要成分之一，能夠損傷生物膜和線粒體，是建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡一種比較常用的誘導(dǎo)劑。本研究以PC12細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，不同濃度UFE-AH進(jìn)行干預(yù)，通過檢測細(xì)胞凋亡率和線粒體跨膜電位及Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)，觀察UFE-AH對(duì)H2O2致PC12細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株和藥物

PC12細(xì)胞，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。PC12細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基，10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素100 mg/mL），置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每隔36 h換液，細(xì)胞貼壁生長至80%密度時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。UFE-AH，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心和甘肅省膜科學(xué)研究院聯(lián)合制備，藥物成分為多糖39.9%、皂苷3.5%、其他56.6%，高效液相檢測指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)控：樣品用50%甲醇溶解，微波助溶，Inertsil ODS-SP G8色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），檢測波長275 nm，甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～20 min，3∶97；20～40 min，20∶80；40～50 min，60∶40；50～60 min，90∶10）[5-6]。

1.2 試劑

30%H2O2溶液，天津富宇試劑有限公司；胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；鏈霉素、青霉素，華北制藥股份有限公司；磷酸緩沖液配制粉，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；1∶250胰蛋白酶，GIBCO公司；AnnexinV-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，德國Miltenyi生物有限公司；二甲基亞砜、MTT試劑、羅丹明123染液、兔抗Bax多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Caspase-3多克隆抗體，美國Sigma公司；辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔IgG，武漢博士德生物工程有限公司；PVDP膜，加拿大BBI公司。

1.3 儀器

BB16UVCO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司），Infinite200 PRO序列多功能酶標(biāo)儀（Tecan奧地利有限責(zé)任公司），PowerPac Universal型電泳儀、Mini Protean 3 Cell小型電泳槽、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司）；AIPhalmager 2200型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國AIPha公司），DYCP3lD型電泳槽、DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠），XL型流式細(xì)胞儀（美國Coulter公司），F(xiàn)V1000激光共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡劑量及作用時(shí)間選擇

選取對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，接種于96孔板中，完全培養(yǎng)基中加入0、50、100、200、300、400 μmol/L H2O2，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、12、24 h，MTT法檢測各組細(xì)胞活力，確定本實(shí)驗(yàn)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的時(shí)間及濃度。

2.2 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物劑量選擇

取對(duì)數(shù)生長期的PC12細(xì)胞，接種于96孔板中，完全培養(yǎng)基中加入0、0.19、0.38、0.75、1.5、3.0 g/L UFE-AH，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，MTT法檢測各組細(xì)胞活力，確定本實(shí)驗(yàn)UFE-AH的劑量。

2.3 分組、造模及給藥

H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，構(gòu)建氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組（正常培養(yǎng)PC12細(xì)胞）、模型組（培養(yǎng)基中加200 μmol/L H2O2）和中藥低、中、高低劑量組。中藥低、中、高低劑量組分別加入0.38、0.75、1.50 g/L的UFE-AH，培養(yǎng)6 h。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

吸棄舊培養(yǎng)基，加PBS 2 mL沖洗后吸棄；消化收集細(xì)胞懸液至EP管，1000 r/min離心5 min；吸棄上清液，加生理鹽水1 mL吹勻成細(xì)胞懸液；1000 r/min離心5 min后加緩沖液；加AnnexinV-FITC 5 μL，避光孵育10 min，加碘化丙啶10 μL避光染色5 min，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.5 激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞線粒體膜電位

取生長狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長期PC12細(xì)胞，將其接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿中，小心吸棄舊培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，吸棄；每孔加入配制好的RH123染料10 μL（終濃度為10 mg/L），避光染色15 min；PBS沖洗3次，吸棄；鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長488～505 nm，發(fā)射波長530 nm，每組選6個(gè)樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)取3個(gè)視野觀測拍照，應(yīng)用Image Pro-Plus 6.0軟件分析細(xì)胞內(nèi)熒光積分光密度（IOD）值/熒光區(qū)域面積（Area）。

2.6 Western blot檢測Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，加蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白質(zhì)（需在冰上進(jìn)行操作）；用考馬斯亮藍(lán)測定蛋白濃度，決定上樣量；取樣品適量至EP管，加上樣緩沖液混勻，沸水中煮10 min使蛋白變性；根據(jù)蛋白測定濃度，每孔加樣20 μL，加Marker作為對(duì)照，經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)PVDF膜；脫脂奶粉（5%）封閉1 h后，加TBST置搖床漂洗4次，每次5 min；分別加10 μL Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3抗體，37 ℃孵育20 min，4 ℃冰箱過夜；次日37 ℃孵育20 min，加TBST漂洗4次，每次5 min；以β-actin作內(nèi)標(biāo)，加2 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min；加TBST漂洗4次，每次5 min；加ECL發(fā)光試劑孵育，在暗室將膜在感光膠片上曝光、顯像，掃描進(jìn)行灰度分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。用Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3與β-actin灰度比值表示細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 過氧化氫誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡模型結(jié)果

與0 μmol/L H2O2組比較，50、100、200、300、400 μmol/L H2O2組細(xì)胞活力下降，且細(xì)胞活力下降與H2O2的濃度呈一定相關(guān)性，200 μmol/L H2O2 PC12細(xì)胞活力下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與0 μmol/L H2O2組比較，H2O2作用6 h時(shí)細(xì)胞活力下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。故確定H2O2濃度為200 μmol/L作用時(shí)間6 h構(gòu)建PC12細(xì)胞凋亡模型。

4.2 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對(duì)PC12細(xì)胞增殖的影響

與0 g/L UFE-AH比較，0.19、0.38、0.75、1.5、3.0 g/L UFE-AH對(duì)PC12細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，在0.38～1.50 g/L及作用時(shí)間24 h內(nèi)存在一定量效和時(shí)效關(guān)系，0.38 g/L UFE-AH作用PC12細(xì)胞18 h、0.75 g/L UFE-AH作用PC12細(xì)胞12 h、1.5 g/L UFE-AH作用PC12細(xì)胞6 h均有明顯的促增殖效應(yīng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

4.3 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對(duì)過氧化氫損傷PC12細(xì)胞凋亡的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組早期凋亡細(xì)胞（D4象限細(xì)胞）百分率明顯上升（P<0.05），正常細(xì)胞（D3象限細(xì)胞）百分率明顯下降（P<0.05）；與模型組比較，中藥中、高劑量組正常細(xì)胞（D3象限細(xì)胞）百分率明顯上升，早期凋亡細(xì)胞（D4象限細(xì)胞）百分率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

4.4 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對(duì)過氧化氫損傷PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組PC12細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度、細(xì)胞線粒體膜電位明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

4.5 當(dāng)歸紅芪超濾膜提取物對(duì)過氧化氫損傷PC12細(xì)胞Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組PC12細(xì)胞中Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量明顯增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯下降，Bcl-2/Bax比值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組PC12細(xì)胞Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著增加，Bcl-2/Bax比值顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見表3、圖3。

5 討論

生理狀態(tài)下，機(jī)體的氧化水平與抗氧化水平保持著動(dòng)態(tài)平衡，對(duì)機(jī)體不構(gòu)成傷害。然而，當(dāng)機(jī)體處于特定的環(huán)境因素、壓力或者疾病狀態(tài)下，這種平衡被破壞，機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化水平失衡，導(dǎo)致大量ROS在細(xì)胞中堆積，不能被及時(shí)清除，會(huì)造成組織器官的損傷，從而引起疾病的發(fā)生，稱氧化應(yīng)激。H2O2是強(qiáng)氧化劑，屬于外源性的ROS，當(dāng)將其作為一種膜通透性的ROS被加入細(xì)胞培養(yǎng)體系后，可直接破壞細(xì)胞或線粒體膜性結(jié)構(gòu)，從而引起細(xì)胞的凋亡。線粒體在調(diào)節(jié)凋亡的過程中起著關(guān)鍵作用。細(xì)胞凋亡過程中許多重要事件的發(fā)生都與線粒體密切相關(guān)，包括Caspases激活因子的釋放，如細(xì)胞色素C、電子傳遞鏈的改變，線粒體膜電位的喪失，細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀的改變，Bcl-2家族促進(jìn)和抑制凋亡蛋白的參與等[7]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的重要組成部分，是凋亡途徑下游進(jìn)行底物酶解的關(guān)鍵蛋白酶，正常情況下，Caspase-3以無活性的蛋白酶原形式存在（即pro-Caspase 3），當(dāng)受到信號(hào)刺激后，酶解為活性酶碎片（即cleaved Caspase 3），cleaved Caspase 3的表達(dá)量可以反映出細(xì)胞的凋亡水平，而Bcl-2蛋白屬于抗凋亡蛋白，可通過調(diào)控谷胱甘肽等的水平調(diào)控核內(nèi)氧化還原平衡以達(dá)到控制Caspase的活性抑制凋亡的作用[8-10]。在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族的抗凋亡與促凋亡蛋白通過形成異源二聚體并定位于線粒體外膜上發(fā)揮作用，對(duì)維持線粒體膜的完整性、維持正常的線粒體跨膜電位、抑制線粒體膜間隙蛋白細(xì)胞色素C的釋放有重要意義，Bcl-2/Bax比值降低細(xì)胞趨向凋亡，Bcl-2/Bax比值升高細(xì)胞趨向存活[11]。本研究應(yīng)用200 μmol/L H2O2作用PC12細(xì)胞6 h成功構(gòu)建氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡模型，研究結(jié)果顯示，H2O2作用PC12細(xì)胞6 h可明顯造成細(xì)胞線粒體膜電位的異常，誘導(dǎo)Bax、cleaved Caspase-3高表達(dá)，進(jìn)而引發(fā)凋亡的發(fā)生。應(yīng)用UFE-AH干預(yù)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，UFE-AH通過改善H2O2損傷的PC12細(xì)胞線粒體膜電位異常，降低Bax、cleaved Caspase-3的表達(dá)，升高Bcl-2的表達(dá)，抑制H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

針對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷，中醫(yī)多從補(bǔ)腎入手，依據(jù)填精益髓的理論展開研究，本研究依據(jù)精血同源理論，從氣血論治神經(jīng)細(xì)胞損傷修復(fù)，選方依據(jù)益氣養(yǎng)血名方當(dāng)歸補(bǔ)血湯。紅芪為豆科植物多序巖黃芪的干燥根，與黃芪功效相當(dāng)?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其具有良好的抗自由基、抗氧化、抗腫瘤及提高免疫力等作用[12]。當(dāng)歸乃臨床最常用的補(bǔ)益藥之一，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射、提高免疫力等功效[13]。UFE-AH是當(dāng)歸、紅芪按1∶5比例混合，利用膜超濾技術(shù)，有效去除藥物中雜質(zhì)，保留藥物有效成分，研究顯示具有抗自由基、抗氧化損傷、抗衰老、抗輻射、促進(jìn)血管新生等功效[14-17]。當(dāng)歸為血中氣藥，具有活血補(bǔ)血之功，紅芪有益氣升陽之力，二藥合用補(bǔ)氣生血之力強(qiáng)，氣血旺則精生，精生則髓長。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生能量的場所，中醫(yī)氣血理論與其密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)UFE-AH對(duì)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能有積極調(diào)控作用，可以對(duì)抗H2O2對(duì)PC12細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)與功能的破壞，防治其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示益氣養(yǎng)血中藥有助于氧化應(yīng)激損傷神經(jīng)細(xì)胞的康復(fù)。

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（收稿日期：2015-09-02）

（修回日期：2015-10-12；編輯：華強(qiáng)）