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        葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度及β—胡蘿卜素積累的影響

        2016-05-30 17:15:20劉偉王婷馮佳呂俊平劉琪謝樹蓮
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年1期
        關(guān)鍵詞:葡萄糖氧化酶胡蘿卜素

        劉偉 王婷 馮佳 呂俊平 劉琪 謝樹蓮

        摘要:為了解外源物質(zhì)對(duì)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)生長和β-胡蘿卜素積累的影響,本試驗(yàn)以分離自運(yùn)城鹽湖的一株鹽生杜氏藻(D.salina YCOI.)為材料,在培養(yǎng)基中添加外源葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C,研究其對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和p一胡蘿卜素含量的影響。結(jié)果表明,葡萄糖氧化酶濃度9mg/L、細(xì)胞色素C濃度lμmol/L時(shí),鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量同時(shí)最大,因此,為兩種外源物質(zhì)的最優(yōu)添加濃度。

        關(guān)鍵詞:鹽生杜氏藻;葡萄糖氧化酶;細(xì)胞色素C;細(xì)胞密度;β-胡蘿卜素

        中圖分類號(hào):S555+.6

        文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào):A 文章編號(hào):1001-4942(2016)01-0040-04

        β-胡蘿卜素(β-Carotene)呈橙黃色,分子式為C40 H56,廣泛存在于植物及真菌中,被認(rèn)為是一種重要的抗癌物質(zhì),具有抗氧化、增強(qiáng)免疫、防治心血管疾病、抗輻射和光敏損傷以及轉(zhuǎn)化為維生素A等作用,對(duì)放療產(chǎn)生的副作用有一定的減緩功效。β-胡蘿卜素還被世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)認(rèn)定為A類營養(yǎng)色素,在全世界50多個(gè)國家和地區(qū)作為食品添加劑和著色劑使用。

        鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)是一種單細(xì)胞嗜鹽藻類,也是一種重要的經(jīng)濟(jì)藻類。它是生產(chǎn)β-胡蘿卜素的天然資源,其合成和積累的β-胡蘿卜素可高達(dá)干重的14%,具有良好的市場前景。鹽生杜氏藻的培養(yǎng)及β-胡蘿卜素的積累機(jī)理在20世紀(jì)90年代前后就有報(bào)道。之后,鹽生杜氏藻培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)及影響因素、二步培養(yǎng)法等陸續(xù)報(bào)道。我國也有關(guān)于鹽生杜氏藻培養(yǎng)方面的研究報(bào)道。章麗等從鹽生杜氏藻中克隆了影響β-胡蘿卜素積累的關(guān)鍵酶β-胡蘿卜素羥化酶基因,并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)分析,研究其對(duì)β-胡蘿卜素合成的調(diào)控作用。

        有報(bào)道稱添加外源葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C可促進(jìn)β-胡蘿卜素的積累,但其對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素合成的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)以分離自山西運(yùn)城鹽湖的一株鹽生杜氏藻為材料,通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖氧化酶和細(xì)胞色素C,研究其對(duì)細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素合成的影響,以期為優(yōu)化培養(yǎng)條件、最大限度獲取β-胡蘿卜素提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料和儀器

        試驗(yàn)所用鹽生杜氏藻藻種(Dunaliella salinaYC01.)分離自山西省運(yùn)城鹽湖。

        培養(yǎng)基為Dunaliella培養(yǎng)基,pH 7.5,光照強(qiáng)度20000 lx,溫度(25±1)℃,光周期16h:8h,每日搖動(dòng)數(shù)次。

        試驗(yàn)所用試劑均為分析純。試驗(yàn)所用儀器主要有光照培養(yǎng)箱(SPX-250B-G,上海博訊);紫外可見分光光度計(jì)(752PC,上海光譜);生物顯微鏡(SK200,麥克奧迪);全自動(dòng)制冰機(jī)(IMS-30,常熟雪科);超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(SCIENTZ-IID,寧波新芝);高速冷凍離心機(jī)(HC-2518R,中科中佳)。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 葡萄糖氧化酶濃度優(yōu)化初步優(yōu)化:設(shè)置7個(gè)葡萄糖氧化酶濃度梯度,分別為0、2、5、8、12、16、20mg/L。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量。

        精細(xì)優(yōu)化:以初步優(yōu)化結(jié)果為依據(jù),加入由初步優(yōu)化得到的最佳葡萄糖氧化酶濃度范圍,設(shè)置5個(gè)濃度梯度,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

        1.2.2 細(xì)胞色素C濃度篩選 根據(jù)上一步試驗(yàn)結(jié)果,加入葡萄糖氧化酶最佳濃度,再加入細(xì)胞色素C,設(shè)置4個(gè)濃度梯度,分別為0、1、2、3卜Lmol/L。每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)14d后測(cè)定細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素的含量。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        分別采用PASW Statistics 18.O、Oringin 8.0以及Photoshop CS5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和做圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 葡萄糖氧化酶濃度的初步優(yōu)化

        從圖1可以看出,在試驗(yàn)范圍內(nèi),當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較低時(shí)(≤8mg/L),鹽生杜氏藻細(xì)胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高,但是當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較高時(shí)(≥8mg/L),鹽生杜氏藻細(xì)胞密度隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降,細(xì)胞密度最高范圍出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8-12mg/L之間。

        從圖2可以看出,在試驗(yàn)范圍內(nèi),葡萄糖氧化酶對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量的影響與細(xì)胞密度變化趨勢(shì)一致。當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較低時(shí)(≤8mg/L),鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而升高,但是當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度較高時(shí)(≥8mg/L),鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素含量隨著葡萄糖氧化酶濃度的升高而下降,β-胡蘿卜素含量最高范圍也出現(xiàn)在葡萄糖氧化酶濃度8~12mg/L之間。

        2.2 葡萄糖氧化酶濃度的精細(xì)優(yōu)化

        精細(xì)優(yōu)化是以初步優(yōu)化的結(jié)果為依據(jù),設(shè)置5個(gè)濃度梯度,分別為8、9、10、II、12mg/L。

        從圖3可知,在設(shè)置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi),鹽生杜氏藻的細(xì)胞密度雖有一些波動(dòng),但無顯著性差異。

        從圖4可以看出,在設(shè)置的葡萄糖氧化酶濃度梯度范圍內(nèi),鹽生杜氏藻的β-胡蘿卜素含量有一定差異,當(dāng)濃度為9mg/L時(shí),β-胡蘿卜素含量最高,且相對(duì)其它處理有顯著性差異。

        綜合鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量的研究結(jié)果,葡萄糖氧化酶的最優(yōu)濃度為9mg/L。

        2.3 細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和β-胡蘿卜素含量的影響

        從圖5可以看出,與對(duì)照相比,添加外源細(xì)胞色素C可使鹽生杜氏藻細(xì)胞密度增加,且呈顯著性差異;但各處理間,鹽生杜氏藻細(xì)胞密度無顯著性差異。

        從圖6可以看出,細(xì)胞色素C對(duì)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的含量有影響。當(dāng)細(xì)胞色素C濃度為1μmol/L時(shí),β-胡蘿卜素含量顯著高于其它處理。

        綜合上述,適宜鹽生杜氏藻生長和β-胡蘿卜素積累的最佳細(xì)胞色素C濃度為1μmol/L。

        3 討論與結(jié)論

        在β-胡蘿卜素合成代謝途徑中,β-胡蘿卜素羥化酶是體系的關(guān)鍵酶,它能以β-胡蘿卜素為底物,催化生成玉米黃質(zhì)。β-胡蘿卜素羥化酶是一種非血紅素雙鐵單加氧酶,其作用機(jī)制為通過獲得光合電子傳遞鏈中鐵氧還蛋白傳遞的電子,在含鐵的酶活性中心利用活化的分子氧去打斷該酶的相關(guān)化學(xué)鍵而起作用。β-胡蘿卜素羥化酶的活化嚴(yán)格依賴分子氧的存在并以鐵氧還蛋白為電子供體,因此尋找該酶的活性抑制劑,調(diào)控相關(guān)過程,對(duì)促進(jìn)鹽生杜氏藻β-胡蘿卜素的積累非常重要。

        研究表明,葡萄糖能夠誘導(dǎo)藻類和植物體β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá),因而不利于β-胡蘿卜素的積累。有氧條件下,葡萄糖氧化酶專一性地催化β-D-葡萄糖等底物的降解,進(jìn)而下調(diào)β-胡蘿卜素羥化酶基因的表達(dá)。同時(shí),該催化反應(yīng)發(fā)生時(shí)消耗分子氧使體系中的活性氧分子甚至是氧原子減少,進(jìn)而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性。因此,葡萄糖氧化酶的存在有利于β-胡蘿卜素的積累。

        細(xì)胞色素C屬于線粒體內(nèi)膜呼吸鏈上的傳遞蛋白,從細(xì)胞色素C還原酶接受電子傳遞給細(xì)胞色素C氧化酶。外源細(xì)胞色素C能夠?qū)⒐夂献饔眠^程中由鐵氧還蛋白傳遞給β-胡蘿卜素羥化酶的電子轉(zhuǎn)移,使其得不到電子而失去相應(yīng)的活性,因而可以對(duì)相關(guān)底物起到保護(hù)作用。

        本試驗(yàn)即通過轉(zhuǎn)移電子和適度去除培養(yǎng)體系中的活性分子氧進(jìn)而抑制β-胡蘿卜素羥化酶的活性,以達(dá)到增加β-胡蘿卜素積累的目的。從試驗(yàn)結(jié)果看,當(dāng)葡萄糖氧化酶濃度為9mg/L、細(xì)胞色素C濃度為lμmol/L時(shí),鹽生杜氏藻的生長和β-胡蘿卜素積累效果最佳,為該藻的大量培養(yǎng)提供一定參考。

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