曹廣英 吳琪 王云云 張青云 王秀貞 唐月異 孫全喜 王傳堂 關(guān)淑艷

摘要：以抗青枯病花生品種日花l號、山東省花生研究所選育的高油酸花生品種花育662和高產(chǎn)大花生品種花育9610為親本正、反交獲得的F1代種子為材料，利用微衛(wèi)星（SSR）標記技術(shù)鑒定真雜種；從候選的50對SSR引物中篩選得到在親本中有穩(wěn)定、清晰多態(tài)性位點的引物5對，對雜種F1代進行鑒定。結(jié)果表明，四個雜交組合共鑒定出30粒真雜種，并得到形態(tài)學鑒定結(jié)果的確認。

關(guān)鍵詞：花生；SSR；雜種鑒定

中圖分類號：S565.203.7

文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）01-0007-05

花生（Araclzis hypogaea L.）是我國重要的油料和經(jīng)濟作物，在國計民生中占有舉足輕重的地位，故一直以來花生的遺傳育種工作都受到高度重視。目前，利用具有優(yōu)良性狀的育成品種進行雜交選育花生新品種，仍是最常用、最有效的育種方法。隨著分子生物學、花生基因組學以及生物信息學的發(fā)展，分子標記技術(shù)在輔助花生育種中的作用也不斷體現(xiàn)出來，尤其是對雜種F1代的鑒定工作，而這也是雜交育種的關(guān)鍵問題之一。傳統(tǒng)的鑒定工作一般是根據(jù)父、母本的形態(tài)學特征進行判斷，但由于高產(chǎn)育種中父母本的趨同性越來越強，通過形態(tài)學鑒定不僅周期長而且可靠性差，而分子標記輔助鑒定的方法能夠準確、方便、快捷地鑒定F1代種子真?zhèn)?，不必等到F1代長成植株再作判斷。SSR（Simple SequenceRepeat）標記具有在基因組中分布廣泛、多態(tài)性高、共顯性、檢測程序簡單等諸多優(yōu)點，被廣泛應用于花生育種工作。

本研究利用SSR標記鑒定四個花生雜交組合的F1代種子，建立基于SSR的花生雜種鑒定技術(shù)體系，以期為后續(xù)育種工作提供鑒定技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1供試材料

本試驗以抗青枯病北方大花生栽培品種日花1號、山東省花生研究所選育的高油酸花生品種花育662和高產(chǎn)大花生品種花育9610正、反交F1代群體為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取采用SDS抽提法。用刀片切一薄片花生子葉0.19加入1.5mL離心管中，加入0.2mL SDS提取液（0.01mol/LTris-HCl，0.1% SDS），用研磨棒研磨，55℃水浴30min，后加入酚：氯仿：異戊醇（25∶24∶1）溶液0.2 mL充分混勻，12000r/min離心10min，取上清，加入等體積的異丙醇，12000r/min離心10min，沉淀用70%乙醇漂洗，風干后溶于50μL TE緩沖液，保存在-20℃冰箱備用。

1.2.2 SSR標記篩選 從公開發(fā)表的文獻中選取50對SSR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。利用這50對SSR引物對父、母本進行多態(tài)性分析，選擇條帶清晰、穩(wěn)定、有明顯差異的標記用于F1代雜種鑒定。

1.2.3 F1代雜種鑒定 以雜種Fi代種子DNA為模板，使用篩選出的SSR標記進行PCR擴增，同時具有父母本擴增帶型的樣品為真雜種。

PCR反應體系（20μL）為：2×Taq PCR Mas-ter Mix（DBI Bioscience）10μL，正、反向SSR引物（10μmol/L）各0.5μL， ddHO8₂μL， 30ng/μLDNA模板1.0μL。反應程序為：94qC預變性5min；94℃變性30s，55℃退火45s，72℃延伸2miii，35個循環(huán)；72℃再延伸5min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳檢測，銀染顯色并拍照存檔。

1.2.4 葉片形態(tài)鑒定 將上述鑒定出的真雜種和父、母本播種于大田中，待植株長至70天左右，取主莖自上向下第三片真葉進行葉片形態(tài)比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本間SSR多態(tài)性標記篩選

利用50對SSR引物對親本日花1號、花育662和花育9610進行多態(tài)性分析，篩選出5對多態(tài)性好的引物（表1），用于F1代雜種鑒定。

2.2 F1真假雜種鑒定

用篩選出的引物檢測4個雜交組合的146粒F1代種子，每個雜交組合用兩對SSR引物相互驗證，結(jié)果共鑒定出30個真雜交種（表2）。F1代真雜種同時具有父本和母本雙方的譜帶，呈共顯性，而假雜種只有母本的條帶（圖1～6）。

2.3 葉片形態(tài)鑒定

親本日花1號葉片呈長橢圓形，葉片最寬的部位在葉片縱軸的二分之一處?；ㄓ?62葉片呈橢圓形，葉片最寬處在葉片縱軸的三分之一處，葉縱軸最遠處略呈尖端。花育9610葉片呈倒卵形，葉片最寬處在葉片縱軸的三分之一處，葉縱軸最遠處略圓。第1個和第3個雜交組合皆是以日花1號為母本，但其F1代葉片與母本差別較大，形狀比母本葉片短，葉色也較母本深，葉片形狀更傾向于父本葉片（圖7A和圖7C）。同樣，第2個和第4個雜交組合中F1代葉片較母本變長，葉片縱軸遠端變尖，包含了父本葉片的形態(tài)特征（圖7B和圖7D）。試驗結(jié)果表明，真雜種葉片均包含有父本葉片性狀，與SSR鑒定結(jié)果一致。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的真假雜種鑒定一般采用形態(tài)標記進行，往往鑒定周期長，容易受外界環(huán)境因素影響，存在較大的誤差，一些性狀差異小的品種鑒定往往比較困難。而DNA分子標記反映的是遺傳本質(zhì)上的差異，能夠從分子水平準確快速地鑒定品種真實性，用于雜種鑒定時周期短且不受環(huán)境條件的影響，結(jié)果真實可靠。目前DNA分子標記已廣泛應用于花生雜種鑒定研究中。SSR標記技術(shù)具有簡便、多態(tài)性高、能檢測出微小變異等優(yōu)點，是進行花生雜交種鑒定的理想標記。本試驗利用SSR標記技術(shù)鑒定花生四個雜交組合F1代中的真雜種，每一個組合都使用兩對SSR引物進行鑒定，相互印證，保證了結(jié)果的準確性。田間植株葉片形態(tài)檢驗結(jié)果表明，子代葉片都包含有父本葉片性狀，與分子鑒定結(jié)果一致。因此，利用SSR分子標記進行花生真假雜種鑒定是可行的。