周雅智 姜玲 黃勇

摘要：多倍化是植物進化過程中的自然現象，也是植物進化的重要源泉。在前期的研究中，通過生物信息學分析發(fā)現二倍體的白菜型油菜中存在兩個擬南芥SDG2的同源基因BraSDG2a（Bra037086）和BraSDG2b（Bra039562）。經序列比對，選取258 bp的保守序列構建RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi。通過浸花法轉化野生型擬南芥（Col-0），經抗性篩選及PCR檢測，獲得1株表型穩(wěn)定的轉基因植株。通過對T4代轉基因擬南芥（純合體）的表型觀察發(fā)現，BraSDG2 RNA干擾轉基因植株具有擬南芥sdg2突變體相似的生物學表型，植株弱小、種子稀少。本試驗為進一步研究BraSDG2的生物學功能奠定基礎。

關鍵詞：白菜型油菜；BraSDG2；RNA干擾；擬南芥；遺傳轉化

中圖分類號：S634.301文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）10-0007-05

據估計，50%～70%的被子植物在其進化過程中至少經歷過1次多倍化過程[1]，基因表達的變化在多倍體化過程中起著重要作用[2]。組蛋白甲基化修飾作為一種重要的表觀遺傳修飾，在參與重塑染色質結構與基因表達方面起到重要作用，其主要包括賴氨酸和精氨酸的甲基化[3]。組蛋白賴氨酸（K）甲基化修飾包括組蛋白H3的K4、K9、K27、K36和組蛋白H4的K20的單、雙和三甲基化的修飾狀態(tài)。組蛋白H3K4及H3K36的甲基化修飾被認為參與基因表達的激活，而H3K9、H3K27和H4K20的甲基化修飾則被認為與基因沉默及異染色質結構的維持相關[4]。

擬南芥SDG2編碼一個包含2 335個氨基酸的蛋白質，其含有SET、Post-SET、GYF保守結構域，具有特異的H3K4me3甲基轉移酶活性。SDG2突變后，擬南芥的育性完全喪失，50%的四分體包含小孢子的數量少于四個，且BT3、SPL、MS1、EDA31、MEE65等11個與雄配子發(fā)育相關基因的表達發(fā)生明顯下調[5]。因此，SDG2介導的H3K4me3甲基轉移酶活性影響著雄配子體的發(fā)育及植物育性。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）所介導的基因沉默現象，它在轉錄、轉錄后以及翻譯水平上干擾基因的表達。RNAi技術是一種研究功能未知基因的有效方法。我們前期的研究表明，在二倍體的白菜型油菜中，BraSDG2具有2個拷貝，并具有不同的組織表達模式，這些結果暗示在基因多倍體化過程中組蛋白甲基轉移酶基因的命運可能發(fā)生了明顯分化[6]。本研究擬通過構建BraSDG2的RNA干擾載體，經浸花法轉化哥倫比亞野生型擬南芥（Col-0），篩選BraSDG2基因沉默的穩(wěn)定遺傳的轉基因擬南芥植株并觀察其表型特征，為進一步研究白菜型油菜BraSDG2的生物學功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

白菜型油菜（Brassica rapa）B2；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α；根癌農桿菌GV3101；載體pMD19-T vector和pFGC5941（含PPT抗性）。以上試驗材料均來自湖南農業(yè)大學植物發(fā)育與表觀遺傳調控實驗室。

1.2試驗方法

1.2.1白菜型油菜BraSDG2-RNAi片段的克隆從Tair與白菜基因組數據庫BRAD收集擬南芥SDG2、白菜BraSDG2a和BraSDG2b CDS序列，經比對分析后選取一段258 bp的保守序列，命名為BraSDG2-RNAi。設計引物序列BraSDG2-RNAi F：5′-CCATGGTCTAGATTGGTGGGCTGCCAGATTG-3′（下劃線分別表示NcoⅠ、XbaⅠ酶切位點）；BraSDG2-RNAi R：5′ -GGCGCGCCGGATCCGATCCCCAAACACACGTCTCATAAC-3′（下劃線分別表示Asc Ⅰ、BamHⅠ酶切位點）。

高保真酶PCR擴增后獲得RNA干擾目的片段，切膠回收后連接到pMD19-T載體上，命名為pMD19-T-BraSDG2-RNAi，將連接好的載體通過熱激法轉化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑選PCR檢測為陽性的單菌落提取質粒測序。

1.2.2RNAi載體的構建使用BamH Ⅰ和Xba Ⅰ雙酶切載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和pFGC5941。將反向BraSDG2-RNAi片段導入終止子與CHSA intron之間，獲得中間載體p-BraSDG2-RNAi；再通過AscⅠ和NcoⅠ對載體pMD19-T-BraSDG2-RNAi和p-BraSDG2-RNAi進行雙酶切，將正向BraSDG2-RNAi片段導入35S啟動子與CHSA intron之間，最終獲得RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi。對獲得的RNA干擾載體進行酶切驗證。

1.2.3擬南芥的遺傳轉化及篩選將pFGC5941-BraSDG2-RNAi導入到工程菌GV3101后，挑選陽性菌落用于擬南芥轉化。通過浸花法將該重組質粒轉化至野生型擬南芥（Col-0）中，采用濃度為100 mg/mL的PPT篩選T0代擬南芥轉化子。設計檢測引物35S825 F：5′-ATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTT-3′，Intron825 R：5′-TGAC-TCCATCTTATTCCCTCCGTTTC-3′，對獲得的抗性苗進行PCR檢測篩選轉基因植株。

1.2.4轉化子的表型觀察將野生型、T3代和T4代（純合體）轉基因擬南芥種子經4℃春化2～3 d后，置于22℃長日照（16 h/8 h）條件下培養(yǎng)37 d，對其進行表型觀察。

2結果與分析

2.1BraSDG2-RNAi片段的克隆

經序列比對，選取一段長度為258 bp的保守序列作為RNAi片段，命名為BraSDG2-RNAi，并成功克隆到該基因片段，見圖1。將克隆的目的片段與pMD19-T載體連接并導入感受態(tài)工程菌DH5α中，選取編號為13和16的兩個陽性單菌落（圖2）送至公司測序。結果如圖3所示，目的

片段與預期片段比對，序列基本一致（5個位點的差異是由于本實驗室所提供的白菜型油菜品種與白菜基因組數據庫品種有所差異導致）。

2.2BraSDG2干擾載體的構建

將BraSDG2-RNAi片段正反向插至目的載體pFGC5941上，結構如圖4所示。通過酶切驗證，確認BraSDG2 RNA干擾載體pFGC5941-BraSDG2-RNAi構建成功，酶切后的片段大小與預期一致，如圖5所示。

2.3擬南芥的遺傳轉化

經浸花法將構建的重組質粒轉化野生型擬南芥（Col-0），通過100 mg/mL PPT篩選得到抗性苗并進行PCR檢測，擴增結果如圖6所示。結果顯示，獲得了1株轉基因植株。

2.4BraSDG2 RNAi轉基因植株表型觀察

在相同長日照條件下（16 h/8 h），對生長37 d的T3、T4代 BraSDG2 RNAi轉基因擬南芥植株與Col-0進行觀察。相比Col-0，T4代BraSDG2 RNAi轉基因植株（純合體）形態(tài)特征表現為植株矮小且出現敗育現象（圖7），其表型與擬南芥sdg2缺失突變體相近。

3討論與結論

組蛋白賴氨酸甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳學標記，其作用機理是通過特異的組蛋白賴氨酸甲基轉移酶催化改變染色質結構，間接影響基因表達，在植物生長發(fā)育中起到重要的生物學作用。擬南芥核組蛋白的賴氨酸殘基被甲基化常見的有4類， histoneH3lysine4（H3K4）、H3K9、H3K27、H3K36?，F有研究的基因組規(guī)模分析的結果顯示不同位點不同程度的甲基化會導致轉錄異常，從而影響基因的表達[7-15]。

研究表明，擬南芥的大多數基因都存在組蛋白甲基化現象，其中發(fā)揮重要作用的就是組蛋白賴氨酸甲基轉移酶（histone lysine methyltransferase，HLMT），這是一類包含130～150個氨基酸保守 SET結構域的蛋白[16]，該保守結構域也是其發(fā)揮催化作用的活動中心。SDG蛋白家族都含有SET結構域，擬南芥SDG2功能表現為特異性地催化組蛋白，對H3K4位點造成雙甲基化與三甲基化，從而調控相關基因表達[17]。

已有試驗表明，對擬南芥SDG2進行RNAi，會導致植株弱小、葉片變小、根長變短、蓮座葉數目變少。本研究通過序列比對獲得白菜型油菜中與擬南芥SDG2同源的基因片段BraSDG2-RNAi，并構建BraSDG2 RNA干擾載體轉化擬南芥，結果表明構建的載體可以有效干擾擬南芥SDG2基因的表達，BraSDG2 RNAi擬南芥轉基因純合植株表型與sdg2擬南芥突變體相似，都表現為植株矮小且育性極低，從而佐證了組蛋白甲基化轉移酶SDG2同系物在植物中是高度保守的。有研究顯示，擬南芥SDG2的缺失導致H3K4me3甲基轉移酶在體內劇烈下降，突變體具有強烈的多向性的表型以及許多基因的錯誤調控，植株矮小和敗育就是其中重要的表型[18]。本試驗證明了白菜型油菜中SDG2的同系物BraSDG2可能對H3K4me3甲基轉移酶具有相似的功能，該結果為進一步研究組蛋白甲基轉移酶SDG家族的作用機制與白菜中BraSDG2的生物學功能奠定基礎。

參考文獻：

[1]Masterson J. Stomatal size in fossil plants： evidence for polyploidy in majority of angiosperms[J]. Science， 1994，264（5157）：421-423.

[2]Wendel J F. Genome evolution in polyploids[J]. Plant Mol. Biol.， 2000，42（1）：225-249.

[3]Martin C， Zhang Y. The diverse functions of histone lysine methylation[J]. Nat. Rev.Mol.Cell Biol.， 2005，6（11）：838-849.

[4]Liu C， Lu F， Cui X， et al. Histone methylation in higher plants[J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2010，61：395-420.

[5]Berr A， McCallum E J， Ménard R， et al. Arabidopsis SET DOMAIN GROUP2 is required for H3K4 trimethylation and is crucial for both sporrophyte and gametophyte development[J]. Plant Cell， 2010，22（10）：3232-3248.

[6]Huang Y， Liu C， Shen W H， et al. Phylogenetic analysis and classification of the Brassica rapa SET-domain protein family[J]. BMC Plant Biol.， 2011，11：175.

[7]Lippman Z， Gendrel A V， Black M， et al. Role of transposable elements in heterochromatin and epigenetic control[J]. Nature， 2004，430 （6998）：471-476.

[8]Turck F， Roudier F， Farrona S， et al. Arabidopsis TFL2/LHP1 specifically associates with genes marked by trimethylation of histone H3 lysine 27[J]. PLoS Genet.，2007，3（6）：e86.

[9]Zhang X， Clarenz O， Cokus S， et al. Whole-genome analysis of histone H3 lysine 27 trimethylation in Arabidopsis[J]. PLoS Biol.，2007，5（5）：e129.

[10]Bernatavichute Y V， Zhang X， Cokus S， et al. Genome-wide association of histone H3 lysine nine methylation with CHG DNA methylation in Arabidopsis thaliana[J]. PLoS ONE， 2008，3（9）：e3156.

[11]Oh S， Park S， van Nocker S. Genic and global functions for Paf1C in chromatin modification and gene expression in Arabidopsis[J]. PLoS Genet.， 2008，4（8）：e1000077.

[12]Zhang X. The epigenetic landscape of plants[J]. Science， 2008，320（5875）：489-492.

[13]Zhang X Y， Bernatavichute Y V， Cokus S， et al. Genome-wide analysis of mono-， di- and trimethylation of histone H3 lysine 4 in Arabidopsis thaliana[J]. Genome Biol.， 2009， 10：R62.

[14]Charron J B， He H， Elling A A， et al. Dynamic landscapes of four histone modifications during deetiolation in Arabidopsis[J]. Plant Cell， 2009， 21（12）：3732-3748.

[15]Jacob Y， Stroud H， LeBlanc C， et al. Regulation of heterochromatic DNA replication by histone H3 lysine 27 methyltransferases[J]. Nature， 2010， 466：987-991.

[16]宋江華，曹家樹. 植物SET蛋白[J]. 細胞生物學雜志， 2007， 29（3）：384-388.

[17]Xu L， Zhao Z， Dong A， et al. Di- and tri- but not monomethylation on histone H3 lysine 36 marks active transcription of genes involved in flowering time regulation and other processes in Arabidopsis thaliana[J].Molecular and Cell Biology， 2008， 28（4）：1348-1360.

[18]Guo L， Yu Y， Law J A， et al. SET DOMAIN GROUP2 is the major histone H3 lysine 4 trimethyltransferase in Arabidopsis[J]. PNAS， 2010， 107（43）：18557-18562.