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摘 要 纖維素酶是重要的水解酶，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及新陳代謝發(fā)揮著重要作用。為了解茶樹(shù)中纖維素酶的活性變化特征，以茶樹(shù)品種‘鳧早2號(hào)為研究對(duì)象，測(cè)定其不同組織結(jié)構(gòu)中纖維素酶3種主要組分內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的活性。結(jié)果顯示，內(nèi)切葡聚糖酶在茶樹(shù)一芽四葉中隨著葉片成熟度增加，酶活性增加，表現(xiàn)為：第四葉>第三葉>第二葉>第一葉>芽，與β-葡萄糖苷酶活性呈現(xiàn)相反趨勢(shì)；外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶都是在第四葉活性最低。內(nèi)切葡聚糖酶在茶樹(shù)花朵中活性最高，而外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶分別在葉片、果皮中活性最高。胞質(zhì)蛋白中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性顯著高于膜蛋白中的酶活性，但胞質(zhì)蛋白、膜蛋白中都未檢測(cè)到外切葡聚糖酶活性。

關(guān)鍵詞 茶樹(shù)；組織器官；亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；纖維素酶 ；酶活性

中圖分類號(hào) S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

纖維素酶是一類多組分的復(fù)合酶系，各組分間具有協(xié)同作用，能夠?qū)⒗w維素降解成葡萄糖[1]。纖維素酶做為一種細(xì)胞壁水解酶，在植物整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期間都有重要作用[2]。目前根據(jù)酶的作用方式不同，纖維素酶主要分為3 種：內(nèi)切葡聚糖酶（endo-glucanase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-glucanase，EXG）以及β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，BG）。內(nèi)切葡聚糖酶與植物的組織生長(zhǎng)、器官成熟、果實(shí)脫落密切相關(guān)[3]；外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶都能通過(guò)糖基化反應(yīng)參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[4]。

茶樹(shù)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，主要生長(zhǎng)在氣候濕熱的熱帶、亞熱帶地區(qū)。茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育周期中以及后期的茶葉加工過(guò)程容易受多種因素影響，而纖維素酶就是影響因素之一。β-葡萄糖苷酶能夠催化茶樹(shù)糖苷類香氣前體的水解反應(yīng)，與芳樟醇、香葉醇等香氣物質(zhì)的生成密切相關(guān)，其產(chǎn)生的茶樹(shù)香氣物質(zhì)不僅參與茶樹(shù)對(duì)病蟲(chóng)害的防御反應(yīng)，還是茶葉重要的物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。在烏龍茶加工過(guò)程中，做青前期有效地發(fā)揮纖維素酶的活性，不僅可以促使可溶性糖類較多的積累，而且可以破壞細(xì)胞間的胞壁區(qū)隔，促進(jìn)水分和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，并激發(fā)后續(xù)反應(yīng)，從而為茶葉奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[7]。

目前，纖維素酶組分之一的β-葡萄糖苷酶在茶樹(shù)中的研究很豐富，而關(guān)于茶樹(shù)的內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的研究幾乎未見(jiàn)報(bào)道。已知纖維素酶各組分間存在協(xié)同作用，對(duì)茶樹(shù)的影響是一系列的復(fù)雜反應(yīng)，因此本研究通過(guò)分析其3個(gè)主要組分在茶樹(shù)嫩梢不同部位及不同組織器官中的活性變化，并從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面分析纖維素酶活性在茶樹(shù)葉片細(xì)胞中的差異，希望為研究纖維素酶對(duì)茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育的影響及在茶葉加工過(guò)程中的作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2015年9月份在本實(shí)驗(yàn)室及試驗(yàn)茶園進(jìn)行，以試驗(yàn)茶園中的茶樹(shù)[Camellia sinensis （L.）O. Kuntze]品種‘鳧早2號(hào)為供試材料。

1.2 方法

1.2.1 茶樹(shù)粗酶液的提取 稱取茶樹(shù)葉片、花、莖、果皮及種胚等新鮮樣品2 g，加入冰鎮(zhèn)的20 mL 100 mmol/L檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.0），以及等量的聚乙烯吡咯烷酮（Polyvingypyrrolidone，PVPP）和0.5 g石英砂，在冰上用研缽迅速研磨至勻漿。勻漿液在8 000×g下低溫離心5 min ，取上清液再以10 000×g 低溫離心10 min，上清液即為茶樹(shù)組織粗酶液[8]。

1.2.2 纖維素酶各組分活性測(cè)定方法 內(nèi)切葡聚糖酶活性測(cè)定采用DNS（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）試劑法，將200 μL茶樹(shù)樣品粗酶液、200 μL 5 g/L羧甲基纖維素鈉（內(nèi)切葡聚糖酶底物）和600 μL 100 mmol/L檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液（pH5.0）加入10 mL離心管中，49 ℃保溫3 h后，加入3 mL DNS試劑，煮沸10 min進(jìn)行顏色反應(yīng)。將待測(cè)樣品反應(yīng)前加3 mL DNS試劑并煮沸10 min設(shè)為對(duì)照，所有樣品用紫外分光光度儀于540 nm下測(cè)吸光值[9]。外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定時(shí)，底物為10 mmol/L PNPC（4-Nitrophenyl-beta-D-cellobioside，

PNPC）和10 mmol/L p-NPG（4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside，p-NPG），反應(yīng)體系及條件與內(nèi)切葡聚糖酶相同，反應(yīng)結(jié)束后，加入2.5 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，用紫外分光光度儀于405 nm下測(cè)定吸光值，將待測(cè)樣品反應(yīng)前加2.5 mL Na2CO3設(shè)為對(duì)照[10-11]。

1.2.3 酶活性計(jì)算方法 內(nèi)切葡聚糖酶活性計(jì)算方法：利用還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)體系中生成的葡萄糖含量，以每毫升粗酶液每10 min催化生成1 μmol葡萄糖為1個(gè)酶活單位。外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶活性計(jì)算方法：用對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)體系中生成的對(duì)硝基苯酚含量，以每毫升粗酶液每10 min催化生成1 μmol對(duì)硝基苯酚為1個(gè)酶活單位。

1.2.4 茶樹(shù)葉片胞質(zhì)蛋白、膜蛋白分離提取及SDS-PAGE電泳 利用膜蛋白分級(jí)分離和胞質(zhì)蛋白提取試劑盒（FOCUSTM Global Fractionation，G-Biosciences）分離提取茶樹(shù)葉片細(xì)胞全蛋白中胞質(zhì)蛋白、膜蛋白，方法與步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。蛋白電泳采用12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），以考馬斯亮藍(lán)R-250染色[12]，用凝膠成像系統(tǒng)BIORAD Gel DOCTM XR拍照分析，蛋白圖譜采用BIORAD凝膠定量軟件Quantity one將條帶標(biāo)出。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)一芽四葉不同部位中纖維素酶活性分析

如圖1所示，茶樹(shù)一芽四葉不同部位中酶活性變化趨勢(shì)為：內(nèi)切葡聚糖酶隨著茶樹(shù)葉片成熟度的增加，酶活性增加，在第四葉中酶活性最高，為單芽中酶活的 3.16倍，整體趨勢(shì)表現(xiàn)為第四葉>第三葉>第二葉>第一葉>芽；外切葡聚糖酶活性在第二葉中最高，分別是第三葉、第四葉中酶活的1.36、2.15倍；β-葡萄糖苷酶活性在單芽中活性最高，隨著葉片成熟度增加，酶活性緩慢降低，第四葉中酶活性為單芽中的82.95%。整體看來(lái)，在茶樹(shù)嫩梢不同部位中內(nèi)切葡聚糖酶活性變化趨勢(shì)與外切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶存在負(fù)相關(guān)性，另外，在同等反應(yīng)體系及條件下，茶樹(shù)新梢中β-葡萄糖苷酶活性比外切葡聚糖酶活性高。

2.2 茶樹(shù)不同組織器官中纖維素酶活性變化

如圖2所示，茶樹(shù)花朵中內(nèi)切葡聚糖酶活性比其他部位強(qiáng)烈，尤其是完全展開(kāi)的花朵中酶活性最高，為3.51U/（10 min·mL），分別是葉片、莖段、果皮的13.67、72.41、15.23倍，而外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在花朵中的活性則比較低。外切葡聚糖酶在茶樹(shù)葉片中的酶活性高于其他組織器官。β-葡萄糖苷酶活性在果皮中有最高值，但是在茶樹(shù)果皮中卻無(wú)法檢測(cè)到外切葡聚糖酶活性。另外對(duì)茶樹(shù)種胚中的纖維素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，卻無(wú)法檢測(cè)到各組分的酶活性，這與種胚中的內(nèi)含物，如大量的淀粉相關(guān)，導(dǎo)致粗酶液呈現(xiàn)渾濁而無(wú)法檢測(cè)。

2.3 茶樹(shù)葉片細(xì)胞膜蛋白、胞質(zhì)蛋白分離提取與纖維素酶活性分析

利用試劑盒分離提取茶樹(shù)葉片細(xì)胞中胞質(zhì)蛋白（SPE）和膜蛋白（MPE），后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，結(jié)果表明SPE與MPE的SDS-PAGE電泳圖譜相似，主要條帶均有7個(gè)，其分子量相似（圖3）。酶活性測(cè)定中，SPE與MPE中可以檢測(cè)到內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，但是未能檢測(cè)到外切葡聚糖酶的活性。MPE中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性分別是SPE中的44.29%、38.75%，顯著低于SPE。

3 討論與結(jié)論

3.1 茶樹(shù)不同組織器官中纖維素酶的活性差異

內(nèi)切葡聚糖酶基因在植物的不同發(fā)育階段均可以被誘導(dǎo)表達(dá)，如植物的開(kāi)花、果實(shí)成熟及其器官脫落等過(guò)程。 草莓EG基因Cel1在果實(shí)成熟過(guò)程中特異表達(dá)[13]；而擬南芥EG基因Cel1則在正在伸展的幼嫩組織中表達(dá)[14]。番茄內(nèi)切葡聚糖酶基因cel5和cel6與花的脫落有關(guān)，不同的是cel6在花脫落整個(gè)過(guò)程中有持續(xù)表達(dá)，而cel5只在花脫落后期中有表達(dá)[15]。本研究結(jié)果表明花朵中內(nèi)切葡聚糖酶活性強(qiáng)烈，與其他組織器官中酶活性相比差異顯著，尤其是完全展開(kāi)的花朵中酶活性最高，這與前面研究報(bào)道的結(jié)論相一致[13-15]。β-葡萄糖苷酶在植物種子中含量最多，尤其是發(fā)芽部位、幼嫩組織和子葉基部[16]。茶樹(shù)葉片中β-葡萄糖苷酶活性在秋季高，春季低，在幼嫩部位活性高[17-18]。本試驗(yàn)中β-葡萄糖苷酶在果皮中的酶活相比其他組織器官有顯著性差異，與內(nèi)切葡聚糖酶活性在芽葉部位呈：現(xiàn)相反趨勢(shì)，內(nèi)切葡聚糖酶活性高低趨勢(shì)為：芽<第一葉<第二葉<第三葉<第四葉，而β-葡萄糖苷酶活性趨勢(shì)為：芽>第一葉>第二葉>第三葉>第四葉，這與內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶基因表達(dá)特性有關(guān)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中可通過(guò)基因表達(dá)量分析兩者之間的酶活性差異。

本試驗(yàn)結(jié)果表明外切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶在同一反應(yīng)體系及條件下酶活性顯著差異，表現(xiàn)出外切葡聚糖酶活性在各個(gè)茶樹(shù)組織器官中活性均比β-葡萄糖苷酶活性低。Nigorikawa等[19]在水稻中的研究表明：如果過(guò)量表達(dá)外切葡聚糖酶基因，雖然纖維素酶活性增加，水稻各組織中的糖分也會(huì)增加，但是轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片、葉脈以及葉綠體都出現(xiàn)不同程度的缺陷變異，同時(shí)有部分植株出現(xiàn)不育；而過(guò)量表達(dá)β-葡萄糖苷酶基因，轉(zhuǎn)基因植株與野生型在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程以及果實(shí)成熟過(guò)程中無(wú)差異，并且不會(huì)引起轉(zhuǎn)基因水稻在形態(tài)上的變異。如果過(guò)量表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶，則無(wú)法獲得轉(zhuǎn)基因植株，過(guò)量表達(dá)的內(nèi)切葡聚糖酶對(duì)水稻再生體系存在毒害作用。這些結(jié)果表明，纖維素酶對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要性，同時(shí)也揭示3個(gè)組分內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶植物生長(zhǎng)發(fā)育中所扮演的角色重要性不同，如Rodrigues等[20]研究表明內(nèi)切葡聚糖酶與β-葡萄糖苷酶的協(xié)同水解作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶含量與水解生成的生物量成正比；內(nèi)切葡聚糖酶含量不會(huì)限制水解速率，而β-葡萄糖苷酶含量是影響水解速率的決定因素。

3.2 茶樹(shù)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中纖維素酶的活性差異

擬南芥內(nèi)切葡聚糖酶家族基因分為3個(gè)亞類（α，β和γ），不同亞類調(diào)控著不同的生理生長(zhǎng)過(guò)程 ，其中α亞類基因AT1G70710被定位于細(xì)胞的葉綠體和胞外區(qū)；γ亞家族基因含有與細(xì)胞質(zhì)膜相關(guān)的蛋白域，并與膜結(jié)合的纖維素合成酶一起參與纖維素的合成[1]。植物中的 β-葡萄糖苷酶基因多被定位在質(zhì)體、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)、液泡及線粒體基質(zhì)等亞細(xì)胞器官中表達(dá)[21-22]。茶樹(shù) β-葡萄糖苷酶基因mNRA在細(xì)胞質(zhì)中有表達(dá)信號(hào)[23]。玉米外切葡聚糖酶基因ExGase在細(xì)胞壁與細(xì)胞膜中均有表達(dá)[24]。這些結(jié)果表明，纖維素酶相關(guān)基因在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)。在本試驗(yàn)結(jié)果中，茶樹(shù)葉片胞質(zhì)蛋白與膜蛋白中能夠檢測(cè)到內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，卻無(wú)法檢測(cè)到外切葡聚糖酶活性，可能是通過(guò)此方法提取的蛋白中外切葡聚糖酶活性太低而無(wú)法通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)到。另外，胞質(zhì)蛋白中內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶活性顯著高于膜蛋白中酶活，這也許與內(nèi)切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶基因家族在亞細(xì)胞中的定位及表達(dá)量有關(guān)，也可能與蛋白提取過(guò)程中相關(guān)，先提取胞質(zhì)蛋白，而后進(jìn)行膜蛋白的提取，造成膜蛋白中的酶活性降低。

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