羅小娟 楊娟 陳錦權(quán) 方婷 陳小藝

摘 要：該研究以鮑魚臟器為原料，通過冷提取工藝單因素試驗(yàn)，探討了緩沖液種類、緩沖液pH、料液比、浸提時(shí)間對(duì)鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶活力的影響，并通過正交試驗(yàn)確定提取的最佳工藝。在此基礎(chǔ)上，采用超聲波輔助提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液，確定超聲輔助提取的最佳工藝條件。結(jié)果表明：料液比、緩沖液pH對(duì)提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時(shí)間、緩沖液種類對(duì)提取的影響不顯著。通過比較超聲波輔助提取前后β-葡萄糖苷酶活力的大小，可以看出，超聲波處理有利于鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，最佳提取工藝條件為：緩沖液為0.1mol/L pH3.5乙酸-乙酸鈉，料液比1∶4，浸提時(shí)間4h，超聲時(shí)間20min，超聲功率200W。

關(guān)鍵詞：鮑魚內(nèi)臟；β-葡萄糖苷酶；超聲波；提取

中圖分類號(hào) TQ281 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）18-0016-05

Extraction Technology Optimization of β-glucosidase from Abalone Viscera

Luo Xiaojuan1 et al.

（1College of Food Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002，China）

Abstract：Abalone viscera was used as raw materials，through single-factor experiments of cold extraction process，the main influence factors on β-glucosidase activity from abalone viscera such as buffer types，pH value of buffer solution，solid-liquid ratio and extraction time had been investigated. The optimum conditions were obtained by orthogonal test. Based on that，the ultrasound-assisted method was applied to extract crude β-glucosidase from abalone viscera and optimize the extractive conditions. The experimental results showed solid-liquid ratio and pH value of buffer solution had a significant effect on the extraction（P<0.05），but extraction time and buffer types had no significant effect on the extraction. By comparing the change of β-glucosidase activity of the samples which were treated by the ultrasonic treatment before and after，we found that ultrasonic treatment was conducive to extraction of the abalone viscera crude β-glucosidase. The optimum technology conditions were determined as follows：buffer was 0.1mol/L pH 3.5 acetic acid-sodium acetate，solid-liquid ratio was 1∶4，extraction time was 4h，ultrasonic time was 20min，ultrasonic power was 200W.

Key words：Abalone viscera；β-glucosidase；Ultrasonic；Extraction

鮑魚（Abalone）是一種原始的海洋單殼軟體貝類，屬軟體動(dòng)物門（Mollusca）、腹足綱（Gastropoda）、前鰓亞綱（Prosobranchia）、原始腹足目（Archaeogastropoda）、鮑螺科（Haliotidae）、鮑屬[1]。鮑魚作為名貴的海產(chǎn)品，兼具高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值[2-3]。鮑魚臟器約占鮑魚軟組織總重量的1/3，含有豐富的生物活性物質(zhì)。近年來，相關(guān)研究表明鮑魚臟器多糖含量豐富，具有抗氧化及免疫調(diào)節(jié)活性[4-5]。同時(shí)，已有報(bào)道鮑魚內(nèi)臟中含有多種酶類，Go'mez-Pinchett等研究表明，鮑魚內(nèi)臟中含有纖維素酶、瓊脂水解酶和藻酸酶等消化酶[6-7]，宮國(guó)君等從鮑魚內(nèi)臟中提取出β-1，3-葡聚糖酶粗酶并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究[8]，E.Serviere-Zaragoza對(duì)鮑魚內(nèi)臟中不同組織的消化酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究[9]。然而，國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于鮑魚內(nèi)臟β-葡萄糖苷酶的研究。β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶，能催化水解結(jié)合于末端芳基或羥基與糖基原子團(tuán)之間的非還原性β-D-葡萄糖苷鍵，生成配基和葡萄糖，可應(yīng)用于降解纖維素，在生產(chǎn)上具有廣泛的應(yīng)用[10-11]。為提高鮑魚內(nèi)臟的利用價(jià)值，本研究以皺紋盤鮑內(nèi)臟為原料，采用常規(guī)方法輔以超聲波提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液，探討最佳提取工藝，為該酶的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）材料：皺紋盤鮑內(nèi)臟：漳州歐圣食品有限公司提供；（2）試劑：對(duì)硝基苯基-β-D-葡萄糖苷（p-NPG）購于北京索萊寶科技有限公司；對(duì)硝基苯酚，碳酸鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，檸檬酸，檸檬酸三鈉，乙酸鈉，乙酸，氫氧化鈉均為分析純，購于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；PH SJ-3F pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FA1004A電子天平（上海精天電子儀器有限公司）；HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；UV-6300PC紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；QL-866旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；冰箱（西門子公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 β-葡萄糖苷酶粗酶液的冷提取 先把冷凍的皺紋鮑魚內(nèi)臟解凍，用手術(shù)剪去除其尾部的結(jié)締組織，稱重，按一定比例（w/v）加入4℃預(yù)冷的一定pH緩沖液，用攪拌機(jī)間斷打漿2min，放置于4℃冰箱中浸提一定時(shí)間后，用高速冷凍離心機(jī)離心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.2 β-葡萄糖苷酶粗酶液的超聲波輔助提取 先把冷凍的皺紋鮑魚內(nèi)臟解凍，用手術(shù)剪去除其尾部的結(jié)締組織，稱重，按一定比例（w/v）加入4℃預(yù)冷的一定pH緩沖液，用攪拌機(jī)間斷打漿2min后，放入超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，同時(shí)采用冰浴冷卻，一次超聲時(shí)間5s，間歇時(shí)間10s，處理一段時(shí)間后取出，放置于4℃冰箱中浸提一定時(shí)間后，用高速冷凍離心機(jī)離心（9 000r/min，4℃，30min），取上清液。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的單因素試驗(yàn) 以β-葡萄糖苷酶活力為指標(biāo)，考察緩沖液種類、緩沖液pH、料液比、浸提時(shí)間對(duì)鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶冷提取的影響。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響實(shí)驗(yàn)的3個(gè)主要因素：緩沖液pH、料液比、浸提時(shí)間作為考察因素，在各因素最佳值附近分別取3個(gè)水平，采用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行設(shè)計(jì)，做3因素3水平正交試驗(yàn)，以確定β-葡萄糖苷酶冷提取的最佳工藝，并進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

1.3.5 超聲波輔助提取β-葡萄糖苷酶的單因素試驗(yàn) 從超聲波處理對(duì)鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力影響的角度出發(fā)，采用β-葡萄糖苷酶冷提取的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)所得的最佳提取條件，分別就影響超聲波處理效果的兩個(gè)主要因素：超聲處理時(shí)間、超聲功率，對(duì)所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力進(jìn)行考察。

1.3.6 β-葡萄糖苷酶活力測(cè)定方法 β-葡萄糖苷酶活力的測(cè)定：p-NPG比色法，以400nm處的吸光值來表示β-葡萄糖苷酶活力的大小[]。計(jì)算公式如下：

[酶活力（U）=Y×V2×V×NK×V1×T]

式中：Y為酶促反應(yīng)的吸光度；V1為反應(yīng)體系中酶液體積（mL）；V2為總反應(yīng)液體積（mL）；V為酶液的提取體積（mL）；K為對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；T為反應(yīng)時(shí)間（min）；N為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，回歸方程為y=18.944x+0.0169，R2=0.999 6，斜率K=18.944。

2.2 β-葡萄糖苷酶冷提取工藝的單因素試驗(yàn)

2.2.1 緩沖液種類對(duì)酶活的影響 在浸提時(shí)間為7h，料液比為1∶2（w/v）的條件下，測(cè)定濃度均為0.1mol/L，pH值為3.5的不同種類的緩沖液對(duì)β-葡萄糖苷酶活力的影響如圖2。由圖2可知，緩沖液的種類對(duì)鮑魚臟器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活的影響較明顯，用0.1mol/L pH6.0乙酸-乙酸鈉緩沖液浸提，所提取的上清液中β-葡萄糖苷酶的酶活性最高，故選用乙酸-乙酸鈉緩沖液最為合適。

2.2.2 緩沖液pH對(duì)酶活的影響 在浸提時(shí)間為7h，緩沖溶液為0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比為1∶2（w/v）的條件下，分別測(cè)定不同pH值浸提下粗酶液中β-葡萄糖苷酶活力，見圖3。由圖3可知，緩沖液的pH對(duì)鮑魚臟器粗酶液中β-葡萄糖苷酶活具有顯著的影響。0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液在pH3.0～6.0范圍內(nèi)，隨著pH值的增大，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)；當(dāng)0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液pH為3.5時(shí)，提取粗酶液的酶活力達(dá)到最大值。故應(yīng)選擇pH值為3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液作為鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶的提取液。

2.2.3 料液比對(duì)酶活的影響 在浸提時(shí)間為7h條件下，選擇pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液與鮑魚臟器分別按料液比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5混合，測(cè)定粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力，其結(jié)果見圖4。由圖4可知，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨著料液比的增加而增大，當(dāng)料液比為1∶4時(shí)酶活力達(dá)到最大值；但在料液比達(dá)到1∶4后出現(xiàn)明顯的下降。故提取的料液比應(yīng)為1∶4比較適宜。

2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)酶活的影響 在緩沖溶液為pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比為1∶4（w/v）的條件下，分別測(cè)定浸提時(shí)間為1、3、5、7、9h下粗酶提取液中β-葡萄糖苷酶活力大小，其結(jié)果見圖5。由圖5可知，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)。在浸提時(shí)間為5h時(shí)，酶活力接近最大值。因此，最佳浸提時(shí)間在5h左右比較適宜。

2.3 鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液冷提取工藝的優(yōu)化 正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

根據(jù)極差R值的大小，可得到影響所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的因素主次順序?yàn)椋毫弦罕?緩沖液pH>浸提時(shí)間。

由表2的極差分析和表3的方差分析結(jié)果可以看出，在篩選鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液提取工藝條件的過程中，影響所提β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活的因素按關(guān)鍵性依次為B>A>C，即料液比>緩沖液pH>浸提時(shí)間。其中，料液比、緩沖液pH對(duì)鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時(shí)間對(duì)鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取的影響不顯著。

綜合分析圖6和表3，可以得到提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液最佳工藝條件為：A2 B2 C3，即緩沖液pH3.5，料液比1∶4，浸提時(shí)間4h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 由表4可知，采用最佳工藝條件提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力可達(dá)到140.58 U，與正交試驗(yàn)表中最高基本一致。因此，通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，正交試驗(yàn)的結(jié)果正確。

2.5 超聲波輔助提取單因素試驗(yàn) 在上述試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察在超聲輔助提取過程中，超聲處理時(shí)間、超聲功率對(duì)粗酶液的酶活力的影響。

2.5.1 超聲處理時(shí)間對(duì)酶活的影響 在固定超聲功率為200W時(shí)，考察不同超聲處理時(shí)間對(duì)所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，當(dāng)處理時(shí)間小于20min時(shí)，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力隨時(shí)間的增加而增大；當(dāng)處理時(shí)間大于20min時(shí)，粗酶液的酶活力隨時(shí)間的增大而下降。此結(jié)果出現(xiàn)的原因可能是由于超聲處理時(shí)間短（小于20min），不足以破碎細(xì)胞，釋放細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶；而長(zhǎng)時(shí)間的超聲波振蕩容易引起溫度的劇烈上升，導(dǎo)致局部過熱，β-葡萄糖苷酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)遭到破壞，使部分酶變性失活。故選定超聲處理時(shí)間為20min時(shí)，酶活力最高。

2.5.2 超聲功率對(duì)酶活的影響 在固定超聲時(shí)間為20min時(shí)，考察不同超聲功率對(duì)所提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液酶活力的影響，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知，超聲波的輸出功率對(duì)細(xì)胞破碎效果具有顯著的影響。當(dāng)超聲功率小于200W時(shí)，隨超聲功率的增加，所提的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力逐漸增大；當(dāng)超聲功率在200～600W范圍內(nèi)，粗酶液的酶活力隨功率的增大而下降。該結(jié)果產(chǎn)生的原因可能是由于超聲功率較?。ㄐ∮?00W），超聲功率的增大，有利于液體中空穴的形成，產(chǎn)生更多的空化泡，使細(xì)胞破碎作用增強(qiáng)；而超聲功率過大導(dǎo)致局部過熱，使部分酶變性失活。故超聲功率采用200W較為適宜。

2.6 兩種提取方法的比較 冷提取的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力為140.58U，超聲波輔助提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力為174.71U，酶活力提高34.13U。由此可見，超聲波處理得到的鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力更高，超聲波輔助方法更有利于鮑魚臟器中β-葡萄糖苷酶的提取。

3 結(jié)論

用新鮮的皺紋盤鮑臟器為原料，通過冷提取工藝的單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)、超聲波輔助提取工藝的單因素試驗(yàn)，最后確定了一整套冷提取方法輔以超聲波提取鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的工藝。冷提取方法各因素對(duì)酶活影響：料液比、緩沖液pH對(duì)提取具有顯著性的影響（P<0.05），而浸提時(shí)間、緩沖液種類對(duì)提取的影響不顯著。通過比較冷提取與超聲波輔助提取方法，可以看出，超聲波處理有利于鮑魚臟器β-葡萄糖苷酶粗酶液的提取，其最佳提取工藝條件為：緩沖液為pH3.5的0.1mol/L乙酸-乙酸鈉，料液比1∶4，浸提時(shí)間4h，超聲時(shí)間20min，超聲功率200W。研究結(jié)果為鮑魚臟器酶的開發(fā)利用提供了一定的試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]Nicole Kresge，Victor D.Vacquier，C.David Stout.Abalone lysine：the dissolving and evolving sperm protein[J].BioEssays，2001，23（1）：95-103.

[2]Kyung-A Lee，Eun-Su Shin.Quality Characteristics of Abalone PorridgeWith Viscera[J].Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition，2008，37：103-108.

[3]Jae-Young Je，Soo Yeon Park，Joung-Youl Hwang et al. Amino acid composition and in vitro antioxidant and cytoprotective activity of abalone viscera hydrolysate[J].Journal of Functional Foods，2015，16：94-103.

[4]Bei-Wei Zhu，Li-ShaWang.Antioxidant activity of sulphated polysaccharide conjugates from abalone（Haliotis discus hannai Ino）[J].European Food Research and Technology，2008，227：663-668.

[5]Zhu Bei-Wei，Zhou DL et al.Chemical composition and free radical scavenging activities of a sulphated polysaccharide extracted from abalone gonad（Haliotis Discus Hannai Ino）[J].Food Chemistry，2010，121：712–718.

[6]Da-Yong Zhou，Bei-Wei Zhu，Lu Qiao，et al. In vitro antioxidant activity of enzymatic hydrolysates prepared from abalone（Haliotis discus hannai Ino）viscera[J].Food and Bioproducts Processing，2012，90（2）：148-154.

[7]J.L.Go'mez-Pinchetti，G.Garc'?a-Reina.Enzymes from marine phycophages that degrade cellWalls of seaweeds[J].Mar.Biol.，1993（116）：553-558.

[8]宮國(guó)君，朱蓓薇，楊靜峰，等.皺紋盤鮑內(nèi)臟β-1，3-葡聚糖酶的提取及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品工業(yè)科技，2012（3）：110-113.

[9]E.Serviere-Zaragoza，M.A.Navarrete de1 Toro. Protein-hydrolyzing enzymes in the digestive systems of the adult Mexican blue abalone，Haliotis fulgens（Gastropoda）[J].Aquaculture，1997，157：325-336.

[10]Gefen G，Anbar M，Morag E，et al.Enhanced cellulose degradation by targeted integration of a cohesin-fused 13-glucosidase into the clostridi-um thermocellum cellulosome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2012，109（26）：10298-10303.

[11]Stefanakis D，Margellou A，Psarouli A，et al.Immobilization of glucose oxidase and 2-hydroxybiphenyl 3-monooxygenase in mesoporous sili-ca：characterization studies and construction of an amperometric glu- cose biosensor[J].Anal Lett.，2010，43（16）：2582-2597.

[12]張亮，王清章，李泱，等.蓮子β-葡萄糖苷酶提取及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].食品科技，2008（6）：142-146.