程曉薈　吳瑤瑤　趙延慧　王新東　朱曉靜

摘要：分別采用考馬斯亮藍(lán)法和苯酚-硫酸法測(cè)定雌雄全蝎中蛋白質(zhì)及多糖的含量，研究雌雄全蝎中蛋白質(zhì)及多糖的含量差異。結(jié)果表明：雄蝎中蛋白質(zhì)和多糖含量分別為83.9 mg/g和3.21 mg/g，雌蝎中蛋白質(zhì)和多糖含量分別為68.3 mg/g和4.45 mg/g，雄蝎中含有較多的蛋白質(zhì)，而雌蝎中含有較多的多糖。雌蝎、雄蝎中所含蛋白質(zhì)及多糖的含量存在差異，預(yù)測(cè)其藥效作用也應(yīng)有一定區(qū)別。

關(guān)鍵詞：全蝎；蛋白質(zhì)；多糖；含量測(cè)定；雌雄差異

中圖分類號(hào)：S865.4⁺9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942（2016）03—0130—03

中藥材全蝎Scorpion，為鉗蝎科動(dòng)物東亞鉗蝎Buthus martensii Karsch的干燥體。全蝎味辛、性平、有毒、歸肝經(jīng)，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)的功效。該藥被用于藥方配伍，在中成藥中也有較為廣泛的應(yīng)用。全蝎含有蝎毒、三甲胺、甜菜堿、硫磺酸、棕櫚酸、軟硬脂酸、膽甾醇及銨鹽、卵磷脂等，其中蝎毒為主要有效成分，主要由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成。蝎毒的蛋白質(zhì)成分主要是一類含有20～80個(gè)氨基酸的小分子多肽（通稱為蝎毒素），此外尚含有微量元素鈣、鎂、鐵、銅、鋅等。近年研究發(fā)現(xiàn)，蝎毒中的活性蛋白質(zhì)在鎮(zhèn)痛、抗凝、抗癲癇等方面有效，不僅可直接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞，還能提高機(jī)體自身的免疫功能。多糖所具有的抗腫瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒活性也相繼被發(fā)現(xiàn)。因此，全蝎蛋白質(zhì)、多糖的含量與其藥效有著一定關(guān)系。

全蝎在實(shí)際配伍使用中不區(qū)分雌雄，因此對(duì)于全蝎中蛋白質(zhì)及多糖的含量測(cè)定并未加以區(qū)分。本試驗(yàn)分別測(cè)定雌蝎、雄蝎中蛋白質(zhì)及多糖的含量，探討研究雌、雄全蝎問是否存在差異，以期為全蝎的使用及進(jìn)一步研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

市售7齡活雌蝎及雄蝎，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)生藥系李峰教授鑒定為東亞鉗蝎。

冷凍干燥機(jī)（LGJ-18A，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；超聲波清洗器（KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司）；臺(tái)式離心機(jī)（TDL80-2B，上海安亭科學(xué)儀器廠）；紫外一可見分光光度計(jì)（UV 9100B，北京萊伯泰科儀器有限公司）；真空干燥箱[DZF-3（6020B），上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司]。

牛血清蛋白（BSA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；D-無水葡萄糖（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；苯酚（天津市秋竹科技開發(fā)有限公司）；濃硫酸（萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；石油醚、三氯甲烷、正丁醇、無水乙醇（天津市富宇精細(xì)化工有限公司）?；瘜W(xué)試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1全蝎蛋白質(zhì)及多糖供試品的制備①全蝎凍干粉的制備：將活雌蝎、雄蝎于冷凍干燥箱中冷凍12 h，再分別用高速萬能粉碎機(jī)粉碎，經(jīng)冷凍干燥機(jī)干燥，得雌蝎、雄蝎凍干粉置冰箱備用。

②全蝎蛋白質(zhì)供試液的制備：分別精密稱取雌蝎、雄蝎凍干粉各2.0 g于錐形瓶中，每次加60mL蒸餾水超聲10 min，共超聲3次，分別得雌蝎、雄蝎蛋白質(zhì)供試品溶液。

③全蝎多糖供試液的制備：精密稱取雄蝎凍干粉2.0 g，置索氏提取器中，加入100 mL石油醚，加熱回流提取4 h進(jìn)行脫脂處理，棄去石油醚，揮干，藥渣置具塞三角瓶中加入60 mL蒸餾水，超聲提取30 min，再置90℃水浴中浸提3 h，將提取液離心抽濾，收集濾液，將濾液濃縮至約5mL，加入等體積的sevage液（氯仿：正丁醇=4：1）。振蕩、離心，取水層，再加入等體積的sevage液，重復(fù)操作5次以除凈蛋白。取水層加入4倍體積的無水乙醇，靜置過夜，離心，沉淀用少量無水乙醇洗滌4次，得到沉淀，將沉淀置真空干燥器40℃干燥4 h，得雄蝎多糖粉末。取多糖粉末約5 mg，精密稱定，加水溶解，定容于10 mL量瓶中，即得雄蝎多糖供試品溶液。

按相同方法制備雌蝎多糖供試品溶液。1.2.2雌蝎、雄蝎中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。精密稱取牛血清蛋白50 mg，加水溶解，置250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得牛血清蛋白對(duì)照品溶液（0.2mg/mL）。

精密吸取對(duì)照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置10 mL具塞試管中，各補(bǔ)加蒸餾水至1.0 mL，然后各加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5.0 mL，搖勻，放置5 min。在595 nm波長(zhǎng)處，以第一份溶液為空白，分別測(cè)定吸光度。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取雌、雄蝎蛋白質(zhì)供試液各0.1 mL，分別置10 mL具塞試管中，照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行供試品溶液吸光度的測(cè)定，按回歸方程計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.3雌蝎、雄蝎中多糖含量的測(cè)定 采用苯酚一硫酸法測(cè)定多糖含量。精密稱取105%干燥至恒重的無水葡萄糖25 mg，加水溶解，置250 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，即得葡萄糖對(duì)照品溶液（0.1 mg/mL）。

精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，加水補(bǔ)至1.0 mL，后分別加入5%的苯酚溶液1.0mL，混勻。迅速加入濃硫酸5.0 mL，混勻，室溫靜置20 min。在490 nm波長(zhǎng)處，以第一份溶液為空白，測(cè)定葡萄糖對(duì)照品溶液的吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

精密吸取雌蝎、雄蝎多糖供試液各1.0 mL，分別置10 mL具塞試管中，照上述標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法進(jìn)行供試品溶液吸光度的測(cè)定，按回歸方程計(jì)算多糖含量。

2結(jié)果與分析

2.1考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

2.1.1蛋白質(zhì)含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線 如圖1所示，得回歸方程A=37.582C+0.0083（r=0.9989），具有良好的線性關(guān)系。

2.1.2精密度試驗(yàn) 精密吸取牛血清蛋白溶液0.5 mL，進(jìn)行吸光度測(cè)定，重復(fù)6次，計(jì)算得RSD為0.59%，表明儀器精密度良好。

2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取蛋白質(zhì)供試品溶液1.0 mL，分別于0、15、30、45、60 min測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.21%，表明供試品溶液在1 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.1.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取蛋白質(zhì)供試品溶液1.0 mL共6份，進(jìn)行吸光度測(cè)定，計(jì)算RSD為2.01%，表明方法重復(fù)性較好。

2.1.5加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含量的全蝎蛋白質(zhì)供試品溶液0.05 mL共6份，分別精密加入牛血清蛋白溶液0.2 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。所測(cè)平均回收率為102.4%，RSD為1.82%，加樣回收率符合要求。

2.1.6雌蝎、雄蝎中蛋白質(zhì)的含量 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中蛋白質(zhì)含量，所測(cè)雌蝎中蛋白質(zhì)含量為68.3 mg/g，而雄蝎中為83.9 mg/g。結(jié)果顯示，雄蝎較雌蝎含有較多的蛋白質(zhì)，這與全蝎常規(guī)使用中認(rèn)為雄蝎的藥用價(jià)值更高相一致。

2.2苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量

2.2.1多糖含量測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，得回歸方程為：A=69.077C+0.0222，相關(guān)系數(shù)r=0.9993，具有良好的線性關(guān)系。

2.2.2精密度試驗(yàn) 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.4 mL，進(jìn)行吸光度測(cè)定，重復(fù)6次，計(jì)算得RSD為0.98%，表明儀器精密度良好。

2.2.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取全蝎多糖供試品溶液1.0 mL，分別于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.71%，表明供試品溶液在3 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn) 取同一全蝎多糖粉末6份，照1.2.1及1.2.3方法制備供試品溶液及測(cè)定吸光度，計(jì)算RSD為1.66%，結(jié)果表明供試品測(cè)定符合技術(shù)要求，重復(fù)性良好。

2.2.5加樣回收試驗(yàn) 精密吸取已知含量的全蝎多糖供試品溶液0.5 mL共6份，分別精密加入葡萄糖對(duì)照品溶液0.3 mL，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。所測(cè)平均回收率為98.65%，RSD為1.42%，加樣回收率符合要求。

2.2.6雌蝎、雄蝎中多糖的含量 按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算供試品中多糖含量，所測(cè)雌蝎中多糖的含量為4.45 mg/g，而雄蝎中多糖的含量為3.21 mg/g。結(jié)果顯示，雌蝎較雄蝎中含有較多的多糖，二者存在一定差異。

3小結(jié)與討論

現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，全蝎主要活性成分蝎毒素除具有抗驚厥、抗癲癇和鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜作用外，尚可用于腫瘤等多種疾病的治療，目前已分離得蝎毒素約30種。而蝎毒的有效成分是活性蛋白，雄蝎中蛋白質(zhì)含量相對(duì)雌蝎較多，這也正驗(yàn)證了臨床中雄蝎藥用價(jià)值較好的現(xiàn)象。因此，試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了雌蝎、雄蝎在藥用及食用方面確實(shí)存在著一定差異。

目前，全蝎在中藥材使用過程中并沒有將雌雄區(qū)別。但是，由于野生全蝎數(shù)量減少，大部分全蝎已轉(zhuǎn)由人工養(yǎng)殖提供，養(yǎng)殖戶應(yīng)在養(yǎng)殖過程中將雌蝎、雄蝎分別處理，并對(duì)不同目的的食用者給予不同推薦。