王冬冬　史敏晶　楊署光　田維敏

摘 要 乳管傷口堵塞物的形成決定著排膠時間的長短，乙烯利刺激能顯著延長排膠時間，但目前關(guān)于乙烯利刺激對乳管堵塞物的影響研究很少。以橡膠樹無性系PR107為材料，利用熒光定量PCR和蛋白質(zhì)Western-blot研究了乙烯利刺激對黃色體內(nèi)含物相關(guān)蛋白的基因表達以及蛋白（包括黃色體和C-乳清中）的含量變化的影響，同時利用光學(xué)顯微技術(shù)研究了割口表面蛋白質(zhì)網(wǎng)形成的情況。結(jié)果表明：乙烯利刺激后PR107膠乳中HGN 1、Hevamine A及HEV 1這3個基因的相對表達量均顯著性降低；黃色體中和C-乳清中對應(yīng)的β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶以及橡膠素蛋白含量也顯著性降低；而割口處割面形成的蛋白質(zhì)網(wǎng)明顯多于對照橡膠樹，且隨著排膠時間的延長蛋白質(zhì)積累增多。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；乙烯利；黃色體；基因表達；乳管堵塞

中圖分類號 S794.1 文獻標識碼 A

Abstract Duration of latex flow after tapping is mainly determined by the formation of plug materials at the end of laticifer cut. Ethrel is the most effective stimuli in prolonging the latex flow， but the effect of ethrel on the plugging formation is still not well known. By using fluorescent quantitative PCR， protein western-blot， and light microscopy， the effects of ethrel on the gene expression and content of plugging-related proteins as well as the formation of protein-network on the tapping panel in rubber tree clones PR107 were studied. The results showed that， after stimulation of ethrel， the relative expression level of gene Hevamine A， HGN 1 and HEV 1 in latex all significantly dropped； correspondingly， the content of β-1， 3-glucanase， chitinase and hevein protein in lutoids and C-serum also reduced. Conversely， the protein-network on the tapping panel accumulated more obviously than the control and increased accompany with the latex flow.

Key words Hevea brasiliensis Müll. Arg.； Ethrel； Lutoid； Gene expression； Laticifer plug

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.06.012

橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）排膠時間是決定膠乳產(chǎn)量的三個關(guān)鍵性因素之一，Boatman等[1]發(fā)現(xiàn)乳管傷口會形成堵塞物，堵塞物形成后降低排膠速度從而影響著排膠時間的長短。乙烯利刺激顯著延長排膠時間[2]，但其延長排膠時間的機制尚不清楚。Gomez[3]認為乙烯利刺激能降低橡膠粒子的絮凝活性，延緩橡膠粒子凝集，從而延長膠乳排膠時間；安峰等[4]研究發(fā)現(xiàn)乙烯利刺激能增加橡膠樹膠乳中的水通道蛋白基因HbPIP2；3表達量，并認為HbPIP2；3對乳管中的水平衡起著監(jiān)管作用；Tungngoen等[5]研究認為乙烯利刺激能夠使橡膠樹水通道蛋白大量表達，通過增加乳管細胞含水量稀釋膠乳提高了乳管膨壓，從而加快排膠初速度；然而范思偉等[6]指出乙烯利刺激并不能提高膠乳排膠初速度，史敏晶等[7]進一步證明了乙烯利刺激降低膠乳排膠初速度。乙烯利對乳管的影響復(fù)雜而廣泛，需要從不同的角度去研究。黃色體在乳管堵塞中的作用一直是人們研究的重點，國外學(xué)者普遍認為黃色體破裂導(dǎo)致的膠乳凝固是堵塞的原因[8-10]；而郝秉中等[11-12]，在乳管傷口末端發(fā)現(xiàn)了“蛋白質(zhì)網(wǎng)”，并認為蛋白質(zhì)網(wǎng)在乳管傷口堵塞中起到關(guān)鍵性作用[13]；史敏晶等[14]利用間接免疫熒光定位及激光共聚焦顯微鏡技術(shù)鑒定了蛋白質(zhì)網(wǎng)的主要成分為來自黃色體中的β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶以及橡膠素。這3種蛋白質(zhì)不僅是“蛋白質(zhì)網(wǎng)”的主要組成成分，而且還對橡膠粒子凝集起著重要的作用[15-16]。

為了探明乙烯利刺激后對橡膠樹乳管中這些堵塞相關(guān)的黃色體蛋白有何影響，本文從基因表達以及蛋白質(zhì)含量變化等方面展開了研究，旨在為進一步闡述乙烯利延長排膠機制和橡膠樹乳管堵塞機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗用樹 選用1997年定植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗場二隊的PR107無性系的橡膠樹6株，采用3天1刀，1/2莖圍（1/2S d/3）割膠制度。分別選取3株橡膠樹用2%乙烯利刺激和不處理，乙烯利刺激后48 h割膠。割膠后待膠線雜質(zhì)流盡，用1.5 mL離心管收集干凈膠乳并迅速放入液氮中用于總RNA提取。

選取乙烯利刺激和未刺激的PR107橡膠樹3株，分別在割膠后5 min、剛停排及停排后（割面膠線凝固）3個時間段取材，即以打孔器在割面處取樹皮，注意保留割口上的膠線；遠離割口的健康樹皮作為對照。

1.1.2 試劑、材料和儀器 Tricine、Tris堿、十二烷基磺酸鈉（SDS）由生工生物工程（上海）有限公司生產(chǎn)；明膠為BBI公司生產(chǎn)；環(huán)保封片膠為上海宏茲實業(yè)有限公司生產(chǎn)；固綠、切片石蠟、N-N′雙丙烯酰胺、戊二醛、過硫酸銨（AP）、高碘酸鉀為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；無水乙醇、正丁醇、碘、二甲苯、冰醋酸、氯化鈉、甲醇、醋酸鈉為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；BCIP/NBT底物顯色劑為AMRESCO生產(chǎn)；PVDF膜（0.2 μm）為Millipore生產(chǎn)；堿性磷酸酶標記的兔抗雞、羊抗兔和羊抗鼠二抗為PIERCE生產(chǎn)；SYBR Premix Ex Taq II、EASY Dilution為TaKaRa產(chǎn)品。

Optima L-100XP型超高速離心機為美國Beckman生產(chǎn)；DY-12C型電泳儀，轉(zhuǎn)印槽為北京六一儀器廠生產(chǎn)；NANODROP 2000分光光度儀為美國Thermo生產(chǎn)；Bio-Rad ChemiDocTM MP凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad生產(chǎn)；CFX-384實時熒光定量儀為Bio-Rad生產(chǎn)；LECICA RM2235型石蠟切片機為德國Leica生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 膠乳總RNA提取及cDNA合成 橡膠樹膠乳總RNA提取使用天根公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒，詳細操作參考說明書。檢測總RNA純度、濃度及完整性。按照Thermo公司生產(chǎn)的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，用膠乳總RNA合成的cDNA第一鏈，反應(yīng)體系：①：Oligo（dT）18 primer 0.5 μL，Random Hexamer primer 1 μL，膠乳總RNA 1 μg，加Water （nuclease-free）到12 μL，PCR儀中65 ℃反應(yīng)5 min，冰上放置；②：5×Reaction Buffer 4 μL，dNTPs Mix（10 mmol/L）2 μL，RiboLock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，RevertAid M-MuLV RT（200 U/μL）1 μL，與反應(yīng)后溶液混合，42 ℃反應(yīng)60 min，70 ℃加熱5 min。

1.2.2 引物設(shè)計及合成 根據(jù)巴西橡膠樹β-1，3-葡聚糖酶（HGN 1）、幾丁質(zhì)酶（Hevamine A）及橡膠素（HEV 1）的基因序列設(shè)計引物，序列依次為HGN1-F：5′-CTCCAAAGCCTTACCAATCCT-3′，HGN1-R：5′-ACATCATCCCTGAA AGCACCT-3′；Hevamine A-F：5′-CTTCTTCCCGTCCCTTAG-3′，Hevamine A-R：5′-CCTTCTTGCCTTGCTTGC-3′；HEV1-F：TCATGGCGGAGCAAGTATGGC，HEV1-R：CACACTCAAGCACTTTCCACAGG；內(nèi)參基因引物為HbUbi-F：5′-GGTTCTGAGGCTTCGTGG-3′和HbUbi-R：5′-CATCCTCTAATTGCTTCCCT-3′，引物由立菲生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 熒光定量PCR 參照吳紹華等[17]方法。

1.2.4 Tricine-SDS-PAGE C-乳清采用等體積上樣，上樣量為10 μL。黃色體樣品采用等量上樣，稱取0.1 g黃色體，加入80 μL ddH2O和80 μL 2×上樣緩沖液，混勻后于PCR儀中95 ℃變性20 min，12 000 r/min離心10 min，取10 μL用于SDS-PAGE和Western-blot[18]。分離膠濃度為14%。濃縮膠電壓為40 V，分離膠電壓設(shè)為100 V至電泳結(jié)束。

1.2.5 Western-blot 將SDS-PAGE電泳后凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，每張膜電流30 mA轉(zhuǎn)移100 min。半干碳板電極緩沖含48 mmol/L Tris堿，39 mmol/L甘氨酸，1.3 mmol/L SDS，20%（V/V）甲醇[19]。一抗和二抗均在室溫孵育2～3 h，BCIP/NBT顯色1 min，利用Bio-Rad ChemiDocTM MP凝膠成像系統(tǒng)成像，并利用Image Lab 5.1軟件定量分析PVDF膜上蛋白質(zhì)條帶的強度。

1.2.6 石蠟切片的制備以及汞溴酚藍染色 參照鄧順楠[20]文中方法制備石蠟切片，汞溴酚藍染色，顯微鏡觀察乳管傷口處蛋白質(zhì)積累情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙烯利處理對排膠時間的影響

割膠后記錄排膠時間，以每20 s 1滴為排膠停止。結(jié)果表明，使用乙烯利刺激后排膠時間平均為265.0 min，非乙烯利刺激排膠時間平均為165.5 min，可見乙烯利刺激能極顯著（p<0.01）延長排膠時間（圖1）。

2.2 Hevamine A、HGN 1及HEV 1在膠乳中的表達

以泛素HbUbi基因為內(nèi)參，通過熒光定量PCR技術(shù)，分析乙烯利刺激前后膠乳中Hevamine A（幾丁質(zhì)酶）、HGN 1（β-1，3-葡聚糖酶）及HEV 1（橡膠素）的表達情況。結(jié)果表明（圖2），乙烯利刺激后膠乳中的Hevamine A、HGN 1表達量極顯著性下調(diào)（p<0.01），HEV 1表達量顯著性下調(diào)（p<0.05）。

2.3 黃色體內(nèi)含物蛋白質(zhì)組分分析

SDS-PAGE結(jié)果表明，乙烯利刺激后黃色體的蛋白質(zhì)整體水平下降（圖3-A），尤其是分子量35 ku、25 ku以及10 ku左右的蛋白帶明顯變?nèi)?，表明乙烯利刺激后這3種蛋白的含量明顯低于對照。利用β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶及橡膠素3種蛋白的抗體進行免疫印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35 ku、25 ku以及10 ku蛋白帶分別對應(yīng)的是β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和橡膠素（圖3-B，C，D），與橡膠素抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的還有分子量約20 ku的橡膠素前體。由于橡膠素的分子量較小，轉(zhuǎn)移效率高，在保證大分子量蛋白獲得良好轉(zhuǎn)移情況下，可能存在透膜現(xiàn)象，所以該蛋白出現(xiàn)了免疫條帶較弱的結(jié)果，但是其變化規(guī)律與電泳結(jié)果基本保持一致。對PVDF膜上的免疫印跡蛋白條帶進行定量分析（圖3-E，F(xiàn)，G）結(jié)果表明，乙烯利刺激后β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和橡膠素3種蛋白的含量均顯著性（p<0.05）降低?？梢姡@些蛋白含量的變化與基因表達的變化規(guī)律一致。

2.4 C-乳清蛋白質(zhì)分析

SDS-PAGE結(jié)果表明（圖4-A），乙烯利刺激后C-乳清中的蛋白也發(fā)生了變化。Western-blot結(jié)果表明，C-乳清中β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶和橡膠素3種蛋白質(zhì)在乙烯利刺激后發(fā)生明顯變化（圖4- B，C，D），其中，分子量為25 ku的幾丁質(zhì)酶和分子量約10 ku橡膠素的含量降低，而β-1，3-葡聚糖酶在含量以及蛋白帶型上都發(fā)生了變化。定量分析結(jié)果表明（圖4-E，F(xiàn)，G），乙烯利刺激后C-乳清中的幾丁質(zhì)酶含量和橡膠素含量極顯著性（p<0.01）降低；β-1，3-葡聚糖酶總含量變化未達到顯著性差異，但其中分子量較高的蛋白帶含量顯著性降低，分子量較低的含量變化不明顯。

2.5 乙烯利對乳管傷口割面蛋白質(zhì)網(wǎng)積累的影響

利用汞-溴酚藍染色觀察割口處蛋白質(zhì)網(wǎng)積累情況。結(jié)果表明，遠離割口處的健康樹皮中染色淺，表明乳管中未出現(xiàn)蛋白質(zhì)的積累（圖5-A）；與非刺激割膠樹相比，乙烯利刺激的膠樹割膠后5 min（圖5-B，E）乳管傷口表面被染成藍色的蛋白質(zhì)網(wǎng)形成多；剛停排時割面蛋白質(zhì)網(wǎng)進一步增多（圖5-C，F(xiàn)）；完全停止排膠后（圖5-D，G）乳管傷口表面蛋白質(zhì)網(wǎng)形成多且致密?？梢?，橡膠樹乳管傷口表面蛋白質(zhì)網(wǎng)隨著排膠時間的延長而增多，而乙烯利處理增加了這一蛋白質(zhì)網(wǎng)的積累。

3 討論與結(jié)論

乳管傷口堵塞物的性質(zhì)國內(nèi)外學(xué)者持有不同的觀點，但其中都強調(diào)了黃色體的重要性[16，21，22]。黃色體是橡膠樹乳管中特有的細胞器，幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素是組成黃色體內(nèi)含物蛋白的主要成分[15，23]，大量研究表明，這3種蛋白質(zhì)在橡膠樹乳管堵塞中起著重要作用[14，16，24]。最近研究還表明，黃色體破裂后的黃色體膜碎片也參與了乳管傷口處堵塞物的形成[9-10，25]。乙烯利是當前最有效的排膠調(diào)節(jié)刺激劑，能夠顯著延長排膠時間。研究乙烯利刺激對黃色體內(nèi)含物蛋白的影響對闡明乳管堵塞機制具有重要價值。

筆者研究發(fā)現(xiàn)乙烯利刺激后膠乳中基因Hevamine A、HGN 1及HEV 1表達量均顯著下調(diào)，而黃瑾等[26]認為乙烯利能夠誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因的表達，并且不同品種或不同處理對幾丁質(zhì)酶的表達量影響較大。本研究與黃瑾等的結(jié)果不同可能與使用的品系以及對材料的處理不同有關(guān)。利用Western-blot技術(shù)檢測黃色體內(nèi)含物蛋白組分，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素含量均顯著性減少，與對應(yīng)的基因之間呈正相關(guān)。另外，C-乳清中的幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素蛋白質(zhì)含量也明顯降低，而這些蛋白來自于破裂的黃色體，其含量降低的原因可能與其本身表達量降低有關(guān)，還可能與黃色體破裂程度以及蛋白質(zhì)被截留在乳管傷口末端和割線表面的多少有關(guān)。我們通過汞-溴酚藍染色發(fā)現(xiàn)乙烯利刺激明顯增加排膠過程中割面蛋白質(zhì)網(wǎng)的積累，由于蛋白質(zhì)網(wǎng)主要是由黃色體中的幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素組成[13]。由此推測，幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素在 C-乳清中含量減少的主要原因之一是被大量截留在傷口末端和割線表面。乙烯利刺激降低乳管的排膠初速度[5-6]，也應(yīng)與這些蛋白質(zhì)網(wǎng)堵塞物的大量形成有關(guān)。大量研究表明，幾丁質(zhì)酶、β-1，3-葡聚糖酶和橡膠素是重要的防御性蛋白[27-29]，這些蛋白的積累對受傷的割口明顯的起到抗菌、保護的作用。乙烯利能提高對條潰瘍等病害的抗性[30-31]，推測與蛋白質(zhì)網(wǎng)在割口大量的積累有關(guān)。

參考文獻

[1] Boatman S G. Preliminary physiological studies on the promotion of latex flow by plant growth regulators[J]. J Nat Rubb Res，1966， 19： 243-258.

[2] Pakianathan S W. Some factors affecting yield response to stimulation with 2-chloroethyl-phosphonic acid[J]. Journal of Rubber Research Institute， Malaysia， 1977， 25（1）： 50-60.

[3] Gomez J B. Demonstration of latex coagulants in bark extracts of Hevea and their possible role in latex flow[J]. Nat Rubb Res， 1977， 25： 109-119.

[4] An F， Zou Z， Cai X， et al. Regulation of HbPIP2； 3， a Latex-Abundant Water Transporter， Is Associated with Latex Dilution and Yield in the Rubber Tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）[J]. PLoS One， 2015， 30； 10（4）： e0125595.

[5] Tuggngoen K， Sakr S， Kongsawadworakul P， et al. Aquaporin gens expression in the trunk phloen and in the laticifers of rubber tree[J]. Proc Int Cod Natural Rubber， 2006， 26（11）： 978-996

[6] 范思偉， 楊少瓊. 巴西橡膠樹的乙烯生理學(xué)（下）[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1991， 4： 75-85.

[7] 史敏晶， 程 成， 田維敏. 乙烯利刺激對橡膠樹無性系PR107和RY8-79排膠生理參數(shù)的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2015， 63（5）： 926-932.

[8] Southorn W A， Edwin E E. Latex flow studies I. Electron microscopy of Hevea brasiliensis in the region of the tapping cut[J]. J Nat Rubb Res， 1986， 20： 176-186.

[9] Wititsuwannakul R， Wititsuwannakul D， Sakulborirug C. A lactin from the bark of the rubber tree（Hevea brasiliensis）[J]. Phytochemistry， 1998， 47： 183-187.

[10] Wititsuwannakul R， Pasitkul P， Kanokwiroon K， et al. A role for a Hevea latex lectin-like protein in mediating rubber particle aggregation and latex coagulation[J]. Phytochemistry， 2008b， 69： 339-347.

[11] 郝秉中， 吳繼林， 譚海燕. 橡膠樹乳管切割后的堵塞研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 1996， 17（1）： 1-6.

[12] Hao B Z， Wu J L， Meng C X， et al. Latieifer wound plugging in Hevea brasiliensis： the role of a protein-network with rubber particle aggregations in stopping latex flow and protecting wounded laticifers[J]. J Rubb Res， 2004， 7（4）： 281-299.

[13] 高政權(quán)， 孟曉春， 吳繼林， 等. 巴西橡膠樹乳管肌動蛋白細胞骨架與采膠的關(guān)系[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2003， 24（3）： 22-26.

[14] 史敏晶. 巴西橡膠樹乳管傷口堵塞物形成機制的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2009.

[15] Wang X， Shi M， Wang D， et al. Copmparative proteomics of primary and secondary lutoids reveals that chitinase and glucanasw play a crucial combined role in rubber particle aggregation in Hevea brasiliensis[J]. J Rubb Res Inst Malaya， 2013， 12： 5 145-5 159.

[16] Gidrol X， chrestein H， Tan H L， et al. Hevein， a lectin-like protein from Hevea brasiliensis（rubber tree）is involved in the coagulation of Latex[J]. J Biol Chem， 1994， 269： 9 278-9 283.

[17] 吳紹華， 張世鑫， 楊曙光， 等. 巴西橡膠樹HbMKK4基因的克隆及表達分析[J]. 西北植物學(xué)報， 2015， 35（3）： 440-446.

[18] 史敏晶， 陳月異， 田維敏. 橡膠樹黃色體B-乳清可溶性蛋白質(zhì)電泳分離技術(shù)[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2009， 30（2）： 121-125.

[19] Towbin H， Staehelin T， Gordon J. Electrophoertic transfer of proteins from polyacrylamide gels tonitrocellulose sheets： procedure and some application[J]. Proc Natl Acad Sci USA， 1979， 76： 4 350-4 354.

[20] 鄧順楠. 巴西橡膠樹乳管傷口封閉物積累的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2013.

[21] 史敏晶， 陳月異， 田維敏. pH值對巴西橡膠樹膠乳β-1， 3-葡聚糖酶結(jié)合黃色體膜的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2009， 30（7）： 891-896.

[22] Chrestin H. Biochemical basis for cessation of latex flow and occurrenc of physiological barkdryness[A]. Proc Inst Rubb Conf[C]. Kuala Lumpur， 1985： 17-37.

[23] 史敏晶， 鄧順楠， 陳月異， 等. 巴西橡膠樹膠乳黃色體中多酚氧化酶的活性及其橡膠粒子凝集作用的研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2013， 34（10）： 1 966-1 971.

[24] 陳三鳳. 幾丁質(zhì)酶研究進展[J]. 植物生理通訊， 1989（1）： 8-13.

[25] Shi M J， Cai F G， Tian W M. Ethrel-stimulated prolongation of latex flow in the rubber tree（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）： an Hev b 7-like protein acts as a universal antagonist of rubber particle aggregating factors from lutoids and C-serum[J]. J Biochem， 2016， 159 （2）： 209-216.

[26] 黃 瑾， ?，F(xiàn)周， 金志強. 橡膠樹膠乳幾丁質(zhì)酶基因表達的品種差異[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2004， 25（1）： 1-5.

[27] Parijs J V， Broekaret W F， Goldstein I J， et al. Hevein： an antifungal protein from rubber-tree[J]. Planta， 1991， 183： 258-264.

[28] Ham K S， Kauffmann S， Albersheim P， et al. Host-pathogen interaction： A soybean pathogenesis-related protein with β-1， 3-glucanase antivity release phytoalexin elicitor-active heatstable fragments from fungal walls[J]. Mol Plant Microbe Intreat， 1991， 4（6）： 545-552.

[29] 曾日中. 巴西橡膠樹膠乳黃色體中的病原相關(guān)蛋白[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1998， 4： 43-48.

[30] 郝秉中， 張開明， 吳繼林， 等. 施用乙烯利對提高巴西橡膠樹抗條潰瘍病的作用[J]. 熱帶作物學(xué)報， 1981， 2（2）： 535-537.

[31] 張開明， 郝秉中， 吳繼林， 等. 乙烯利防治橡膠樹條潰瘍病田間試驗[J]. 熱帶作物學(xué)報， 1982， 3（1）： 71-97.