袁夢麒 潘永貴 張偉敏 李藝筱 何鳳平 李尚斌

摘 要 以海南主栽品種‘中白番木瓜為試材，采用15 mmol/L甜菜堿浸泡處理，隨后于冷害溫度6 ℃下貯藏，研究甜菜堿處理對番木瓜冷害及其抗氧化代謝的影響。結果表明，甜菜堿處理可有效地抑制番木瓜果實SOD、POD和CAT酶活性的下降，使超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫濃度保持較低的水平，減少細胞膜透性的增加和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累，減緩了番木瓜果實采后冷害的發(fā)生。

關鍵詞 甜菜堿；番木瓜；冷害；抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號 S667.9 文獻標識碼 A

Abstract The papayas variety‘Zhong Baifrom Cheng-mai was used in the study. After picking， the fruit was immersed in the 15 mmol/L betaine solution and then was stored under 6 ℃ for 40 days. The change of the chilling-injury degree and anti-oxidant system were determined per 10 days. The results suggested that the betaine treatment could efficiently inhibit the decrease of the activities of various enzymes， such as SOD， POD and CAT， keep the degree of super oxygen anion producing rate and hydrogen peroxide concentration low， reduce the increase of cell membrane permeability and the accumulatation of MDA products of membrane lipid peroxidation. It can be concluded that the betaine treatment could inhibit the chilling injury of papayas after picking。

Key words Betaine； Papaya； Chilling injury； Antioxidant system

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.022

番木瓜（Carica papaya L.）果實具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，近年來市場對于番木瓜的需求量逐年上升。但番木瓜屬于呼吸躍變型水果，采后極易軟化腐爛[1]。低溫貯藏能夠保持果實的采后品質，延長其貨架期[2]。但是對于番木瓜這類熱帶亞熱帶水果來說，不恰當?shù)牡蜏貢е鹿麑嵆霈F(xiàn)冷害[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)甜菜堿處理對于果蔬采后冷害有著顯著的緩解作用。甜菜堿（glycine betaine，GB）屬于季胺型水溶性生物堿，是植物組織細胞內(nèi)的一種重要的調(diào)節(jié)物質[4]。GB的積累有助于維持細胞滲透壓、保護細胞膜結構和酶活性，增強植物抗逆性等[3]。研究表明，外源甜菜堿處理桃果實可以有效地降低其細胞膜滲透性和細胞中MDA含量，有效地維持桃果實細胞膜完整性，并減輕桃果實低溫貯藏過程中的冷害[5]。甜菜堿處理有助于提高植物和果實細胞的抗氧化能力。5 mmol/L甜菜堿處理辣椒果實，發(fā)現(xiàn)其過氧化氫酶和過氧化物酶的活性都得到提高，冷害情況也得到緩解[6]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)甜菜堿處理能夠有效地緩解香蕉[7]、黃瓜[8]、枇杷[9]等果實的冷害。但目前對于甜菜堿處理預防或緩解番木瓜采后冷害的研究鮮有報道，本研究以海南‘中白番木瓜為試材，研究甜菜堿處理對番木瓜果實采后低溫貯藏過程中細胞膜透性、MDA含量、O2·- 產(chǎn)生速率和H2O2含量，以及POD、SOD及CAT活性的影響，探討采后甜菜堿處理對番木瓜果實冷害與抗氧化系統(tǒng)的影響，為番木瓜冷藏運輸中的冷害預防提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

‘中白品種番木瓜（Carica papaya L.）采自海南省澄邁縣番木瓜果園，選擇果皮總體呈亮綠色，并有10%左右為黃綠色的果實作為采收果實。果實采收后于2 h內(nèi)運送回實驗室。選擇大小基本一致，無病蟲害的果實，先用0.1%濃度的施保功（拜耳制藥）浸果2 min進行殺菌，而后分成兩組，每個處理組各50個果實：一組用15 mmol/L甜菜堿浸泡10 min（預實驗確定最佳處理條件），另一組用蒸餾水浸泡10 min，作為對照。果實自然風干后，用厚度為0.01 mm的聚乙烯保鮮袋（40 cm×30 cm）包裝，每袋5個果實。置于6 ℃下存放。每隔10 d取樣，每組隨機取6個果實，檢測各項指標，每個指標重復測定3次。

1.2 測定方法

1.2.1 冷害指數(shù) 參照Shadmani[9]的方法略有修改。取30個番木瓜果實用于統(tǒng)計冷害指數(shù)，將冷害程度分為5級。0級：果面完好無冷害癥狀；1級：果皮出現(xiàn)凹陷，有輕微的水漬斑，占果面10%以下；2級：果皮凹陷，有水漬斑，占果面30%以下；3級：果蒂果皮干癟，果皮有明顯水漬斑，占果面50%以下；4級：果蒂果皮嚴重干癟，果皮水漬斑較多，占果面50%以上。

冷害指數(shù)=Σ（冷害級別×該級別個數(shù)）/（最高級數(shù)×總果數(shù)）×100%

1.2.2 腐爛率 腐爛率測定參照王靜等[10]的方法略作修改。按照腐爛面積，將番木瓜果實的腐爛程度分為4級。0級：果皮光潔無損；1級：果面有1～3個小腐爛斑；2級：果實部分腐爛，腐爛面積占果面25%～50%；3級：果實大面積腐爛，腐爛面積占果面50%以上。

腐爛率=Σ（腐爛級別×該級別個數(shù)）/（最高級數(shù)×總果數(shù)）×100%

1.2.3 相對電導率 參照Shadmani等[11]的方法略有修改。每組隨機選取3個果實，在赤道線上相對兩個部位削去2 mm厚的果皮，用內(nèi)徑為0.5 cm的打孔器取果肉組織，切取4片相同厚度（2 mm）的薄片。分別置于20 mL的蒸餾水中浸泡、振蕩1 h。采用電導儀（上海雷磁DDS-370A型）測定電導值R1，煮沸15 min后冷卻至室溫，再測1次電導值R2。以煮沸前后電導率的比值表示細胞膜透性。每個處理重復3次。

1.2.4 丙二醛（MDA）含量 參照Wang等[12]的方法略作修改。準確稱取2 g果肉，加入5 mL 10%的三氯乙酸（TCA）冰浴研磨勻漿后在4 ℃下12 000 r/min離心15 min。取1.5 mL上清液，加入0.67%的TBA 2 mL，煮沸15 min，冷卻后相同條件下離心。分別測上清液在532 nm和600 nm波長處的吸光值。對照管加入2 mL 10%的TCA溶液代替提取液。

1.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性 參照Shadmani等[11]的方法略作修改。準確稱取2 g果肉，加入0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液5 mL（含5% PVP）冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取0.1 mL上清液，加入2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液振蕩搖勻后于240 nm波長處測定吸光值的變化。以每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活單位，酶活性表示為：U/（g FW·min）。

1.2.6 超氧化物歧化酶（SOD）活性 準確稱取2 g果肉，加入0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液5 mL（含5 mmol/L DTT和5% PVP）冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取上清液采用SOD試劑盒（購自南京建成公司，產(chǎn)品編號A001-1）測定SOD活性，并用考馬斯亮藍法測定樣品中蛋白質含量。

1.2.7 過氧化物酶（POD）活性 參照Shadmani等[11]的方法略作修改。準確稱取2 g果肉，加入0.2 mol/L pH7.8磷酸緩沖液5 mL（內(nèi)含1 mmol/L PEG、4% PVP和1% Triton X-100）冰浴研磨成勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心20 min。取0.5 mL上清液加入25 mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液3 mL和0.5 mol/L H2O2溶液0.2 mL反應，然后迅速于470 nm波長處測定吸光值變化。以每分鐘吸光值變化0.01為一個酶活單位，酶活性表示為：U/（g FW· min）。

1.2.8 過氧化氫（H2O2）含量 參照Wang等[12]的方法略作修改。準確稱取2 g果肉，加入5 mL預冷的丙酮在冰浴條件下研磨成勻漿，在4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液，加入1 mL 10%的四氯化鈦的鹽酸溶液和0.2 mL的濃氨水，反應5 min后在相同條件下離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入3 mL 2 mol/L的硫酸，振蕩溶解后于412 nm波長處測定吸光值。以標準H2O2 制作標準曲線。

1.2.9 超氧陰離子（O2·- ）產(chǎn)生速率 參照Cao等[13]的方法略作修改。準確稱取2 g果肉，加入5 mL 50 mmol/L、pH7.8的磷酸鈉緩沖液在冰浴條件下研磨成勻漿，在4 ℃條件下12 000 r/min離心20 min。取1 mL上清液，加入1 mL 50 mmol/L、pH7.8的磷酸鈉緩沖液和1 mL 1 mmol/L的鹽酸羥胺溶液，搖勻于25 ℃保溫1 h。取出后加入1 mL 17 mmol/L對氨基苯磺酸溶液和1 mL 7 mmol/L α-萘胺溶液，搖勻后于25 ℃保溫20 min。于530 nm處測定吸光值。以KNO2溶液制作標準曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS 19.0軟件進行方差顯著性差異分析；另外利用Sigmaplot12.2軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 甜菜堿處理對于番木瓜果實腐爛率及冷害指數(shù)的影響

如圖1-A所示，在低溫貯藏期間，兩組果實的腐爛率均呈上升趨勢，未經(jīng)甜菜堿處理的果實在冷藏期間第20天時已開始發(fā)生腐爛，而甜菜堿處理的番木瓜果實直到30 d時才出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。且到40 d時，對照組果實的腐爛率已達到94%，而甜菜堿處理的番木瓜果實腐爛率只有80%。表明甜菜堿處理能夠有效地抑制番木瓜果實低溫貯藏期間腐爛的發(fā)生。

從圖1-B可看出，對照組和甜菜堿處理的果實在20 d時均出現(xiàn)冷害，且冷害程度隨貯藏時間的延長而上升，貯藏40 d時甜菜堿處理的番木瓜果實冷害指數(shù)較未經(jīng)甜菜堿處理的番木瓜果實低14.67%。整個貯藏期間，甜菜堿處理的番木瓜果實冷害指數(shù)都低于對照，且在20～40 d期間達到顯著差異（p<0.05）。

2.2 甜菜堿處理對于番木瓜果實相對電導率及MDA含量的影響

電導率與細胞膜透性密切相關，MDA是脂質過氧化的主要產(chǎn)物與膜脂過氧化程度有密切關系[14]。如圖2-A所示，隨著貯藏時間的增加，兩組番木瓜果實中相對電導率均呈上升趨勢，到第40天時，對照組和處理組果實相對電導率已分別上升到61%和58%。但甜菜堿處理的番木瓜果實相對電導率在整個貯藏過程中均低于對照組，統(tǒng)計分析表明，二者間呈顯著性差異（p<0.05）；對于MDA而言，對照組和甜菜堿處理的番木瓜果實內(nèi)MDA含量同樣均隨著貯藏時間延長而上升（圖2-B）。并且對照組的番木瓜果實MDA含量明顯高于處理組果實。表明甜菜堿處理可以有效地抑制番木瓜果實內(nèi)相對電導率的上升和MDA的積累。

2.3 甜菜堿處理對于番木瓜果實O2·- 產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

通常認為，低溫對于果實細胞膜結構完整性的破壞與其誘發(fā)的氧化脅迫有關[15]。如圖3-A所示，兩組的番木瓜果實O2·- 產(chǎn)生速率均隨貯藏時間的延長而上升。其中對照組的果實在20 d前上升迅速，之后緩慢升高，而處理組的果實內(nèi)O2·- 產(chǎn)生速率在30 d前上升緩慢，貯藏30 d后迅速增加。在整個貯藏過程中，甜菜堿處理的番木瓜果實O2·- 產(chǎn)生速率均顯著低于對照組（p<0.05）。

對于H2O2，兩組果實均表現(xiàn)出相同的變化趨勢，在貯藏前10 d有所下降，而后逐漸升高，至貯藏末期（40 d）升幅已分別達到151%和157%。甜菜堿處理的番木瓜果實H2O2含量在整個貯藏過程中均低于對照組，且二者之間呈顯著差異（p<0.05）。

2.4 甜菜堿處理對于番木瓜果實SOD、POD和CAT活性的影響

為了緩解活性氧引起的損傷，果實組織內(nèi)產(chǎn)生的活性氧會被POD、SOD和CAT這一類酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng)清除[16]。由圖4-A和4-B可知，兩組番木瓜果實SOD和POD活性在整個貯藏過程中均表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，且均在第20天時達到峰值。并且除了POD在貯藏初期（前10 d）比對照略低外，在整個貯藏過程中，甜菜堿處理的番木瓜果實中SOD活性和POD活性均明顯高于對照組，但在貯藏結束時，兩者SOD活性降到了相似的水平。表明甜菜堿處理有助于提高番木瓜果實SOD和POD活性。

在整個貯藏過程中，兩組果實中CAT活性同樣均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，與SOD和POD不同的是，二者在30 d時達到峰值，然后迅速降低，到貯藏結束（40 d）時，處理組和對照組CAT活性分別為其最大值的76%和69%（圖4-C）。且在貯藏30～40 d期間甜菜堿處理的番木瓜果實CAT活性都明顯高于對照組（p<0.05），表明甜菜堿處理同樣可以提高番木瓜低溫貯藏過程中CAT活性。

3 討論與結論

甜菜堿在果實的低溫脅迫過程中扮演著重要角色。許多植物在低溫脅迫時會迅速合成和積累甜菜堿，以提高其對低溫的抗性[10]。對于甜菜堿減輕果實冷害的機理目前尚未明確。通常認為，低溫對于果實細胞膜完整性的破壞與其誘發(fā)的氧化脅迫有關。有研究認為果實中甜菜堿的積累可以維持細胞內(nèi)滲透壓，并保護細胞中酶，特別是抗氧化相關酶的活性，增強果實清除活性氧的能力，以防止低溫貯藏下果實組織中活性氧的異常升高和細胞膜結構的損害[17]。黃瓜果實經(jīng)外源甜菜堿處理后，其細胞膜透性降低，丙二醛含量明顯降低，SOD酶活性明顯升高[9]。本研究結果也表明，甜菜堿處理顯著地提高貯藏過程中番木瓜果實中SOD、POD和CAT活性，延緩了其活性的下降。而正常低溫情況下，SOD、POD和CAT活性受到抑制[11]。與此相對應，活性氧代謝失調(diào)，細胞中H2O2和O2·- 大量積累，從而導致生物膜脂過氧化，通透性增加并最終致使果實腐爛[18-19]。因此，這些清除自由基酶系活性的升高，將有助于降低活性氧的積累，保持膜的完整性。本研究的結果也表明，甜菜堿處理的番木瓜果實中維持了較低的O2·- 生成速率和H2O2含量。與此相對應，番木瓜果實經(jīng)外源甜菜堿處理后，其MDA和相對電導率明顯低于對照。說明甜菜堿處理有效地維持了低溫貯藏過程中番木瓜果實膜脂結構的完整性。而生物膜構象和結構改變被認為是果實冷害發(fā)生的最初反應，低溫環(huán)境首先對果實生物膜造成傷害[20]。例如遭受冷害的黃瓜細胞內(nèi)的電解質大量外滲，膜透性增大[21]。類似的結果在草菇[22]、茄子[23]、番茄[24]等果蔬上也有報道。因此，膜完整性的保持，將會延緩果蔬冷害的發(fā)生和減輕冷害癥狀。本研究也可以看出，在貯藏中后期，甜菜堿處理的番木瓜果實冷害指數(shù)和冷害引起的腐爛率都明顯低于對照。表明外源甜菜堿處理可以減輕番木瓜果實低溫貯藏過程中的冷害。

總之，本研究表明，甜菜堿處理可以提高番木瓜果實中SOD、POD和CAT等清除自由基酶系的活性，降低果實活性氧O2·- 生成速率和H2O2含量，延緩番木瓜果實中MDA產(chǎn)生和相對電導率的上升，從而延緩低溫貯藏中番木瓜果實冷害的發(fā)生。

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