王　雪，楊　偉，李　靖，馬存花

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞MMP-9及p53表達(dá)的影響

王雪，楊偉＊，李靖，馬存花

［摘要］目的通過(guò)檢測(cè)拉米夫定作用于人肝癌細(xì)胞系（HepG2.2.15）后對(duì)其基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及p53表達(dá)的變化，探討拉米夫定對(duì)原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用。方法不同濃度（100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml）拉米夫定作用于HepG2.2.15細(xì)胞不同時(shí)間（3 d及6 d）后，四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法測(cè)定細(xì)胞增殖活性；雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清及胞質(zhì)中MMP-9及p53蛋白含量。結(jié)果經(jīng)拉米夫定作用后的HepG2.2.15細(xì)胞生長(zhǎng)未受明顯抑制；細(xì)胞中MMP-9及p53的表達(dá)均出現(xiàn)不同程度降低。結(jié)論拉米夫定通過(guò)降低HepG2.2.15細(xì)胞中MMP-9及p53的表達(dá)來(lái)抑制肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

［關(guān)鍵詞］肝細(xì)胞肝癌；HepG2.2.15細(xì)胞；MMP-9；p53；拉米夫定

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最常見(jiàn)、惡性程度最高的腫瘤之一。在亞洲和非洲主要和感染乙肝病毒（HBV）有關(guān)，HBV是HCC的致病因子已被公認(rèn)［1］。肝癌的特點(diǎn)是早期轉(zhuǎn)移，由腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中分泌的幾種生物分子在其發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及p53基因起到了關(guān)鍵作用。拉米夫定作為核苷類似物，通過(guò)終止HBV DNA鏈合成以抑制肝癌的機(jī)制已明確［2］。本實(shí)驗(yàn)用核苷酸類藥物拉米夫定作用于人肝癌細(xì)胞系（HepG2.2.15）后，對(duì)其培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)液中基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及p53表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，探討核苷酸類藥物在分子水平對(duì)肝癌防治的意義。

1　材料與方法

1.1材料HepG2.2.15細(xì)胞株購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。α-MEM培養(yǎng)基和胎牛血清均為Gibco產(chǎn)品。G418購(gòu)自北京格林博遠(yuǎn)生物科技有限公司。胰蛋白酶/EDTA（0.25%/0.53 mM）、青鏈霉素混合液、PBS、MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京Solarbio公司。拉米夫定片購(gòu)自葛蘭素史克公司。MMP-9及p53試劑盒購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)復(fù)蘇HepG2.2.15細(xì)胞，用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基（含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml，200 μg/ml G418），于5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。每3～4 d更換一次培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)使用胰蛋白酶/EDTA （0.25%/0.53 mM）消化，按比例1∶3傳代。

1.2.2四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取對(duì)數(shù)期HepG2.2.15細(xì)胞，用胰蛋白酶/EDTA（0.25%/0.53 mM）消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，按照104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板。設(shè)正常生長(zhǎng)組和不同濃度拉米夫定（100 μg/ml、200 μg/ml、300 μg/ml）組，以不加細(xì)胞僅加培養(yǎng)液的平行孔作為空白對(duì)照。正常生長(zhǎng)組使用常規(guī)培養(yǎng)基，拉米夫定處理組添加不同濃度拉米夫定。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。分別于第0、2、4、6、8 d采用MTT法測(cè)定每組細(xì)胞增殖情況。MTT法具體操作：小心吸棄上清，加入90 μl無(wú)血清培養(yǎng)基及10 μl MTT后于5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)4 h。小心吸棄上清，每孔加入110 μl Formazan溶解液，震蕩10 min待結(jié)晶物充分溶解后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值，計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.3ELISA方法測(cè)定細(xì)胞及培養(yǎng)上清中MMP-9及p53的表達(dá)取對(duì)數(shù)期HepG2.2.15細(xì)胞，按照5×104個(gè)細(xì)胞/孔接種12孔板。設(shè)正常對(duì)照組及拉米夫定處理組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組使用常規(guī)培養(yǎng)基，拉米夫定處理組使用添加不同濃度拉米夫定的培養(yǎng)基。于5%CO2、37℃孵育箱中培養(yǎng)。分別于第3、6天收集細(xì)胞及上清。胰酶消化回收細(xì)胞，12000 r/min離心5 min后棄上清，加200 μl PBS重懸。液氮/37℃水浴反復(fù)凍融法裂解細(xì)胞，重復(fù)三次。12000 r/min離心10 min，留取上清，-70℃凍存。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定細(xì)胞及培養(yǎng)上清中MMP-9及p53的表達(dá)。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件，統(tǒng)計(jì)處理以每組測(cè)定值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)和方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線從圖1曲線可以看出：拉米夫定處理組與正常對(duì)照生長(zhǎng)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差別（P>0.05），說(shuō)明所用拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞沒(méi)有直接毒性殺傷作用。

圖1　MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2HepG2.2.15細(xì)胞及其培養(yǎng)液中MMP-9及p53表達(dá)水平的測(cè)定圖2、3的結(jié)果顯示，在第3、6天，拉米夫定各處理組HepG2.2.15細(xì)胞及其培養(yǎng)液中MMP-9及p53表達(dá)水平分別與正常培養(yǎng)對(duì)照組比較，有明顯降低（P＜0.05）。

圖2　細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中MMP-9的表達(dá)

圖3　細(xì)胞及培養(yǎng)上清液中p53的表達(dá)

3　討論

MMP-9作為一種明膠酶，可以有效降解細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ、Ⅴ型膠原和明膠，研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)系［3-5］。Riedel等［6］報(bào)道，MMP-9可作為腫瘤血管形成的調(diào)控因素參與腫瘤血管形成，MMP-9與VEGF在腫瘤血管形成中起協(xié)同作用。其發(fā)揮作用時(shí)能夠在細(xì)胞的表面對(duì)MMP-2有效地激活，并促進(jìn)MMPs家族其他因子的活化，共同發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用［7，8］。在腫瘤細(xì)胞復(fù)雜的轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)過(guò)程中，MMP-9可通過(guò)刺激腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲，促進(jìn)血管生成而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起核心作用［9，10］，有研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9與肝癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和術(shù)后復(fù)發(fā)相關(guān)［11，12］。此外，MMPs還可以增強(qiáng)血管生長(zhǎng)因子的作用，促進(jìn)新生血管的形成［13，14］。已逐漸成為抗腫瘤治療中重要的藥物作用靶點(diǎn)［15］。p53基因是目前研究較早的抑癌基因，分為突變型和野生型。野生型p53是抑癌基因，對(duì)細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)控作用，野生型p53突變后失去抑癌基因功能，并且與野生型p53結(jié)合成復(fù)合物，抑制p53基因功能，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖［16，17］，可誘導(dǎo)一些異?；虮磉_(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生［18］。并且可以下調(diào)抑制血管增生的凝血酶的反應(yīng)素-1（TSP-1）和上調(diào)促血管增生的VEGF，因而成為調(diào)控腫瘤血管形成的重要因素［19］。

HBV作為一種病毒，它在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制有可能作為激發(fā)p53活性的因素，使p53的表達(dá)及功能增強(qiáng)，進(jìn)而可能導(dǎo)致細(xì)胞某些生物學(xué)活性（如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等）的改變，可能是細(xì)胞感染HBV后的保護(hù)性反應(yīng)。有研究證實(shí)p53失活與MMP-9的表達(dá)在HCC發(fā)展中起協(xié)同作用［20］。Franchi等［21］認(rèn)為，p53的突變可以上調(diào)MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄，并且通過(guò)NOS和EGFR途徑影響MMP-9的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中，拉米夫定處理組細(xì)胞及上清中p53及MMP-9的表達(dá)均降低。進(jìn)而推斷，拉米夫定導(dǎo)致的HBV 及p53、MMP-9的表達(dá)降低可能是一個(gè)良性循環(huán)，對(duì)抑制肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移起重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：核苷類藥物不僅可以直接抑制HBV復(fù)制，還可能通過(guò)某種機(jī)制，降低p53及MMP-9的表達(dá)，從而抑制肝癌的發(fā)生和進(jìn)展。

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［2015-08-15收稿，2015-09-14修回］［本文編輯：韓仲琪］

Effect of lamivudine on the expression of MMP-9 and p53 in HepG2.2.15 cells

WANG Xue①，YANG

Wei，LI Jing，et al.①
Weifang Medical University，Weifang，Shandong 261053，China

［Abstract］Objective To study the inhibitory effect of lamivudine on the formation and development of primary liver cancer by detecting the expression of matrix metalloproteinases-9（MMP-9）and p53 in human hepatocellular carcinoma cell line（HepG2.2.15）.Methods HepG2.2.15 were treated with different concentrations （100 μg/ml，200 μg/ml，300 μg/ml）of lamivudine for 3d and 6d in vitro，the cell proliferation activity of HepG2.2.15 were assayed bv MTT.Double antibody sandwich enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）for the determination of MMP-9 and p53 in the cell culture supernatant and cytoplasm.ResultsThe growth of HepG2.2.15 cells was not significantly inhibited by lamivudine.The expression of MMP-9 and p53 appeared to decrease in different degrees.ConclusionLamivudine inhibits the invasion and metastasis of HCC by reducing the expression of p53 and MMP-9 in HepG2.2.15 cells.

［Key words］HCC；HepG2.2.15 cells；MMP-9；p53；Lamivudine

［中圖分類號(hào)］R735.7

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

［作者單位］261053山東濰坊，濰坊醫(yī)學(xué)院（王雪，馬存花）；261021山東濰坊，解放軍89醫(yī)院（楊偉，李靖）

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.02.025