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HPLC法測(cè)定梨果肉中的熊果苷和綠原酸

摘要：本文采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定梨肉中熊果苷和綠原酸的含量。采用W ondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）為固定相，甲醇：磷酸水（pH 2.5）=25：75（V/V）為流動(dòng)相，流速0.6m l/min，在280 nm、柱溫30℃下進(jìn)行檢測(cè)。本法中熊果苷、綠原酸分別在0.0002～0.01mg/m l、0.001～0.05mg/m l濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為0.9987、0.9994，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.88%、1.04%，標(biāo)準(zhǔn)加入回收率分別為99.2%、99.6%。該方法操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，整個(gè)試驗(yàn)的精密度和回收率良好，可用于梨果肉中熊果苷、綠原酸的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：梨果肉；熊果苷；綠原酸；高效液相色譜法

熊果苷和綠原酸是梨果實(shí)中最具代表性的活性成分。熊果苷又名熊果素，是源于綠色植物的天然活性物質(zhì)，能夠通過(guò)抑制體內(nèi)絡(luò)氨酸酶的形成來(lái)阻止黑色素的形成，是當(dāng)今流行的最為安全的美白原料，也是理想的皮膚美白祛斑活性劑，主要用于高級(jí)化妝品的制備。綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，有抗誘變、保肝利膽、抗菌抗病毒及解痙等作用，在藥品、保健品、食品行業(yè)、化妝品行業(yè)的開發(fā)利用價(jià)值很大。因此，研究梨肉中的熊果苷和綠原酸有十分重要的作用和意義。

目前關(guān)于熊果苷和綠原酸的測(cè)定方法使用最多的就是高效液相色譜法，該方法操作簡(jiǎn)單，分析速度快，準(zhǔn)確度高，可以同時(shí)測(cè)定多種酚類物質(zhì)。本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步優(yōu)化條件，更加準(zhǔn)確、快速地測(cè)定梨果肉中熊果苷和綠原酸的含量。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料。雪梨、鴨梨購(gòu)于邢臺(tái)家樂(lè)園超市。

1.2試驗(yàn)藥品。甲醇、乙腈、熊果苷、綠原酸為色譜純；濃磷酸為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3試驗(yàn)儀器。LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-M 20A二極管陣列檢測(cè)器），日本島津公司；FA2004電子天平，上海精密儀器公司；KQ-50B型超聲波清洗器，天津市瑞普電子儀器公司；SC-3612低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)字式酸度計(jì)，江蘇江分電分析儀器有限公司。

1.4標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。配制濃度為熊果苷0.01mg/m l、綠原酸0.05mg/m l標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.5梨肉樣品的處理。準(zhǔn)確取稱取鴨梨果肉（去皮）10.2208 g，加入80%甲醇100m l，勻漿1min。取上清液20 m l，在4 000 r/m in的轉(zhuǎn)速下，離心10m in，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，進(jìn)樣10μl。

準(zhǔn)確稱取雪梨樣品11.6410 g，按如上步驟制取雪梨樣品。

1.6色譜條件。Wondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶磷酸水（pH2.5）=25∶75 （V/V），流速：0.60m l/m in，在波長(zhǎng)280 nm、柱溫為30℃條件下進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)果與討論

2.1流動(dòng)相的優(yōu)化

2.1.1有機(jī)溶劑含量的選擇。在其他條件保持不變的情況下，探究甲醇：水相（pH2.5）在四個(gè)不同比例（20∶80、25∶75、30∶70、40∶60）下熊果苷和綠原酸的色譜圖（圖1）。

圖1　不同流動(dòng)相比例標(biāo)樣分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；a、b、c、d甲醇∶水相（pH2.5）分別為20∶80、25∶75、30∶70、40∶60

分析圖1和圖2可得，隨著有機(jī)相比例的增加，出峰時(shí)間越來(lái)越短，但是當(dāng)流動(dòng)相比例增加到30∶70、40∶60時(shí)，梨肉樣品中熊果苷峰形明顯不如25∶75時(shí)效果好，所以綜合考慮，流動(dòng)相比例選擇25∶75。

圖2　不同流動(dòng)相比例梨肉樣品分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；e、f、g甲醇：水相（pH2.5）分別為25∶75、30∶70、40∶60

2.1.2水相pH值的選擇。pH值對(duì)出峰時(shí)間和峰形都有一定的影響。在其他條件不變的情況下，設(shè)置4個(gè)磷酸水溶液pH值（2.10、2.50、3.00、3.50）進(jìn)行試驗(yàn)。分析圖3可得知，pH值為3.50時(shí)綠原酸的保留時(shí)間太長(zhǎng)，所以不選擇。pH值為2.10、2.50和3.00時(shí)出峰時(shí)間相當(dāng)，但pH值為2.10時(shí)，接近色譜柱的使用下限，所以不選擇。

圖3　不同pH值標(biāo)樣分離色譜圖注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；h、i、j、k的pH值分別為2.10、2.50、3.00、3.50

結(jié)合圖4得知，pH值為3.00時(shí)，兩個(gè)梨肉樣品中熊果苷的分離效果不及2.50時(shí)的好，所以pH值選擇2.50作為試驗(yàn)條件。

圖4　不同pH值梨肉樣品色譜圖的比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；l、m的pH值分別為2.50、3.00。

2.1.3溫度的選擇。其他條件保持不變，分別探究在室溫22℃和30℃條件下熊果苷和綠原酸的出峰情況，見圖5。30℃時(shí)，熊果苷和綠原酸的出峰時(shí)間早于22℃時(shí)的情況，因此溫度選擇30℃作為試驗(yàn)條件。

圖5　不同溫度的色譜圖比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；n、o分別為22℃、30℃。

2.1.4流速的選擇。保持其他條件不變，分別探究流速為0.6m l/m in和0.8m l/m in時(shí)熊果苷和綠原酸的分離情況，結(jié)果如圖6所示。

圖6　不同流速的色譜圖比較注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；p、q分別為0.6、0.8m l/m in

由圖6可知，流速為0.6m l/m in時(shí)，熊果苷和綠原酸的保留時(shí)間要比0.8m l/m in時(shí)的長(zhǎng)，但綜合考慮理論塔板數(shù)和分離度，流速為0.6m l/min時(shí)理論塔板數(shù)和分離度高于0.8m l/m in，所以流速選擇0.6m l/m in作為試驗(yàn)條件。

表1　不同比例流動(dòng)相中熊果苷和綠原酸的分離情況

2.2線性關(guān)系考察。用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)液，配制成含熊果苷濃度（mg/m l）依次為0.0002、0.0001、0.0025、0.005、0.01的溶液，綠原酸濃度（mg/m l）依次為0.001、0.005、0.0125、0.025、0.05的溶液。進(jìn)樣10μl。以樣品濃度c對(duì)峰面積A作圖，見圖7，熊果苷在0.0002～0.01mg/m l濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其回歸方程為：y=32475762.77 x+6590.85，相關(guān)系數(shù)R2=0.9987。綠原酸在0.001～0.05mg/m l濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程為：y=23136381.58 x+4241.06，相關(guān)系數(shù)R2= 0.9994。

圖7　標(biāo)準(zhǔn)曲線圖注：圖中r、s分別為熊果苷、綠原酸

2.3精密度。取熊果苷和綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)混合液10μl進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定3次，計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），見表2。由表2可知，研究對(duì)象相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為2.88、1.04，結(jié)果表明本試驗(yàn)的精密度良好。

表2　精密度測(cè)定結(jié)果（n=3）

2.4回收率。分別精確移取熊果苷和綠原酸標(biāo)準(zhǔn)試樣，配制成1.5、3.0、4.5μg/m l熊果苷溶液，1.5、3.0、4.5μg/m l綠原酸溶液，三組試樣，在色譜條件下（見1.6），分別進(jìn)樣10μl，根據(jù)所得峰面積用回歸方程計(jì)算回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。熊果苷、綠原酸的平均回收率分別為99.2%、99.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.46%，0.33%。結(jié)果表明，本方法回收率較好，且兩種互不干擾。

2.5樣品測(cè)定。分別準(zhǔn)確吸取在實(shí)驗(yàn)條件（1.5）下制得的雪梨、鴨梨樣品溶液10μl，按色譜條件（1.6）進(jìn)樣。由圖8可見，熊果苷和綠原酸兩組分可以很好的分離、測(cè)定。計(jì)算得出雪梨梨肉中熊果苷含量為7.8667μg/g，綠原酸含量為210.9333μg/g；鴨梨梨肉中熊果苷含量為14.0667μg/g，綠原酸含量為88.2667μg/g。

圖8　梨肉中熊果苷和綠原酸的測(cè)定注：1、2分別為熊果苷、綠原酸；r、s分別為鴨梨、雪梨

3　結(jié)論與展望

本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定了梨肉中熊果苷和綠原酸含量，經(jīng)過(guò)探索分析，得到最優(yōu)色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（250×4.6mm，5μm）為固定相；甲醇—水（25∶75，V/V）為流動(dòng)相，水相是pH值為2.5的磷酸溶液，流速為0.6m l/m in，在波長(zhǎng)280 nm、柱溫30℃下進(jìn)行檢測(cè)。此方法操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短，18m in內(nèi)可完成測(cè)定，分離效果好，線性關(guān)系良好，精密度、回收率高，還可同時(shí)分離和測(cè)定梨果肉中的熊果苷和綠原酸，在梨果實(shí)活性成分研究和檢測(cè)中有重要意義，也為醫(yī)藥保健、食品行業(yè)、化妝品行業(yè)中綠原酸、熊果苷的研究和檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。

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