楊洋　馬玲　　　馬巖　　　陳旭日　潘佳亮　葛康康　姚翰文　劉雪峰

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)　(哈爾濱商業(yè)大學)　　　　　　　　　　　　　　　(東北林業(yè)大學)

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α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病菌作用機理1)

楊洋馬玲馬巖陳旭日潘佳亮葛康康姚翰文劉雪峰

(東北林業(yè)大學，哈爾濱，150040)(哈爾濱商業(yè)大學)(東北林業(yè)大學)

摘要為了探討α-蒎烯衍生物3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙對病原菌的作用機理，采用平板擴散法研究了α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病原菌(Botryosphaeria fusisporae)的抑制作用。結果表明：該衍生物可以抑制山核桃干腐病原菌生長，最大抑制率為63.37%，EC50為0.059 4 g·L-1，可導致山核桃干腐病菌菌絲體生長緩慢、質(zhì)量減輕、菌液中pH值減小程度逐漸變大、電導率明顯升高、大分子物質(zhì)的吸光值增大、可溶性蛋白增加、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性降低。說明α-蒎烯衍生物主要改變病原菌細胞膜的通透性，具有開發(fā)利用的潛力。

關鍵詞α-蒎烯衍生物；作用機理；山核桃干腐病

分類號S763.1

α-pinene Derivative on Action Mechanism ofBotryosphaeriafusisporae//

Yang Yang, Ma Ling

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Ma Yan(Harbin University of Commerce); Chen Xuri, Pan Jialiang, Ge Kangkang, Yao Hanwen, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：88-91,96.

To explore theα-pinene derivative of 3-methoxy-4-hydroxyphenyl-α-pinene maleimido acylhydrazone mechanism of pathogenic bacteria, we used the plate diffusion method to study theα-pinene derivative inhibition ofBotryosphaeriafusisporaepathogens. The derivative can inhibit the growth of B. fusisporae pathogens, the largest inhibition was 63.37%, EC50was 0.059 4 g/L, which led toB.fusisporaepathogens mycelial growth slow weight loss, pH value decrease degree of bacteria gradually increased, the electrical conductivity significantly increased, the absorbance macromolecules increases, the soluble protein increased, POD and CAT activity decreased. Theα-pinene derivative mainly changes the permeability of cell membrane pathogens with the potential development and utilization.

Keywordsα-pinene derivative; Function mechanism; Botryosphaeria fusisporae

山核桃干腐病是山核桃生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)的1種新病害，是一類主要由山核桃干腐病菌(Botryosphaeriafusisporae)引起的病害，又稱潰瘍病[1]。在山核桃主栽培區(qū)普遍發(fā)生，個別地區(qū)受害嚴重，病株上少則幾個病斑，多則幾十個病斑，最嚴重的可達數(shù)百個病斑，發(fā)病率在30%以上，不但影響山核桃的生長和產(chǎn)量，而且嚴重時會導致樹木過早死亡，造成重大經(jīng)濟損失[2]。目前，關于該病的防治方法研究報道較少，只見物理刮除病斑法[3]和化學農(nóng)藥噴灑法[4]。直接刮除病斑會造成樹木產(chǎn)生新的傷口，易再度引發(fā)病菌侵入，且防治效果較短；化學農(nóng)藥噴灑對防治山核桃干腐病效果更好[5]，但從長遠考慮，山核桃是一種高檔干果，對食品安全性要求很高，因此尋找高效、低毒、低殘留的生物防治方法迫在眉睫。

α-蒎烯是多種植物精油活性成分的重要組成部分，是植物揮發(fā)性有機化合物，具有廣譜的抗真菌作用和很強的殺蟲活性[6]。已有研究表明，α-蒎烯以及含有α-蒎烯的植物精油對很多森林害蟲和某些病原菌具有很好的控制作用[7-8]，例如土傳病菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和斜紋夜蛾(Spodopteralitura)。但是α-蒎烯單體對病原菌的作用效果并不理想，所以對α-蒎烯的結構進行修飾改造合成具有更好抑菌效果的衍生物是非常必要的。與此同時，國內(nèi)外對其抗菌機制報道較少，因此，選擇α-蒎烯的1種衍生物3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙處理山核桃干腐病原菌，觀察菌落生長情況，通過比較處理前后菌絲體質(zhì)量的變化以及菌液中pH值、電導率等理化性質(zhì)的變化，并比較α-蒎烯衍生物處理菌絲體后，其過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的差異，旨在探究出α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病的作用機理，為開發(fā)新型植物源殺菌劑，有效防治病原菌提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌種

山核桃干腐病菌(Botryosphaeriafusisporae)菌株，由東北林業(yè)大學林學院森林保護學專業(yè)病理實驗室提供。

1.2試驗方法

1.2.1α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病抑菌試驗

PDA培養(yǎng)基的配制：準確稱量洗凈去皮馬鈴薯200 g，切碎，加入1 L蒸餾水煮沸30 min，用2層紗布過濾至燒杯。分別稱量20 g的葡萄糖和瓊脂，加入煮好的培養(yǎng)基中，充分攪拌使其溶解，定容至1 L，分裝在錐形瓶中高溫高壓滅菌，冷卻后保存?zhèn)溆谩?/p>

山核桃干腐病抑菌試驗：山核桃干腐病菌種接種在固體斜面培養(yǎng)基上，活化2次，然后挑取第2次活化菌種于固體培養(yǎng)基中，25 ℃、131 r·min-1搖床培養(yǎng)。采用平板擴散法[9-10]進行試驗，在超凈工作臺內(nèi)，將直徑0.5 cm菌餅接種在滅好菌直徑為9.0 cm的培養(yǎng)皿中央，在距離菌餅中心水平方向3.5 cm處分別用無菌打孔器打2個孔，在孔內(nèi)分別注入0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·L-1的3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙藥液，以不含藥劑但含相同體積的生理鹽水作為對照，每處理重復3次，25 ℃在霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d。觀察菌落生長情況，并測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率和抑制中濃度EC50。

菌落凈生長量=測得菌落平均值-0.5。

菌絲生長抑制率=((對照組菌落凈生長量-處理組菌落凈生長量)/對照組菌落凈生長量)×100%。

1.2.2菌絲體質(zhì)量及其理化性質(zhì)的測定

將1 mL山核桃干腐病菌的孢子懸浮液(1×107菌落·mL-1)接種到100 mL滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、131 r·min-1搖床中培養(yǎng)。處理組加入1 mL 6.0 g·L-1的α-蒎烯衍生物使得液體培養(yǎng)基中藥液質(zhì)量濃度始終保持在0.06 g·L-1，對照組加入1 mL的生理鹽水，分別測定以下指標。

菌絲體質(zhì)量：培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后，分別取樣5 mL，過濾獲得菌絲體，放入烘箱105 ℃烘干6 h，利用干重法獲得其質(zhì)量。

pH值：培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后，分別取樣，用pH計直接測定培養(yǎng)液的pH值。

培養(yǎng)液電導率：培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后，分別取5 mL培養(yǎng)液，4 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，重復2次。取上清液，稀釋成一定的濃度，用電導率儀測其液體電導率[11]，每個試驗重復3次。R=((Rs-Rc)/Rc)×100%。式中：Rs為處理組電導率；Rc為對照組電導率。

培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值：培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后，分別取5 mL培養(yǎng)液，6 000 r·min-1離心10 min，留沉淀，用PBS緩沖液洗滌，重復2次。利用無菌水將離心后的沉淀制成菌懸液，在260 nm波長下，用紫外分光光度計測定上清液中大分子物質(zhì)的吸光值[12]。對照組為無水乙醇，每個試驗重復3次。

1.2.3培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)量濃度的測定

標準曲線繪制：取6支10 mL具塞試管，按照表1加樣蓋塞后，將各試管中溶液充分混合，放置3 min后用1 cm光經(jīng)比色杯在595 nm波長下比色，記錄各管測定的光密度值，并做標準曲線。

表1　各試管加樣標準

培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)量濃度：將1 mL山核桃干腐病菌的孢子懸浮液(1×107菌落·mL-1)接種到100 mL滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、131 r·min-1搖床中培養(yǎng)。處理組加入1 mL 6.0 g·L-1的α-蒎烯衍生物使得液體培養(yǎng)基中藥液質(zhì)量濃度始終保持在0.06 g·L-1，對照組加入1 mL的生理鹽水。培養(yǎng)12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h后，分別取5 mL培養(yǎng)液，6 000 r·min-1離心10 min，棄沉淀，重復2次。取上清液，稀釋成一定的濃度，取0.5 mL稀釋提取液，加入5 mL考馬斯亮藍G-250試劑在室溫下放置3 min后在595 nm下比色[13]，記錄吸光值，用蒸餾水作對照，每個試驗重復3次。

1.2.4過氧化物酶和過氧化氫酶測定

將1 mL山核桃干腐病菌的孢子懸浮液(107菌落·mL-1)接種到100 mL滅菌后的PDA液體培養(yǎng)基中，25 ℃、131 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別加入適量的α-蒎烯衍生物使得液體培養(yǎng)基中藥液質(zhì)量濃度始終恒定，分別為0、0.04、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20 g·L-1，培養(yǎng)5 d后分別取5 mL培養(yǎng)液，低溫條件下用超聲波細胞破碎儀處理50 s，8 000 r·min-1離心10 min棄沉淀。

過氧化物酶測定：取1 mL上清液作為粗酶液加入比色皿中，將3 mL反應液在室溫25 ℃保溫10 min，立即加入到含粗酶液的比色皿中，對照組加3 mL反應液，于470 nm處測其吸光度值，1 mL 100 mmol·L-1PBS(pH=6.0)緩沖液，每個處理重復3次[14]。以每毫克蛋白每分鐘使反應體系的吸光度降低0.01為1個比活性單位。

過氧化氫酶測定：取1 mL上清液作為粗酶液加入比色皿中，將3 mL反應液在室溫25 ℃保溫10 min，立即加入到含粗酶液的比色皿中，對照組加3 mL反應液，1 mL含30% H2O2150 mmol·L-1PBS(pH=7.5)緩沖液，于240 nm處測其1 min內(nèi)吸光度值的變化，每個處理重復3次[15]。以每毫克蛋白每分鐘使反應體系的吸光度降低0.01為1個比活性單位。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用POLO軟件計算α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病抑制中濃度EC50和95%置信區(qū)間。運用SPSS17.0軟件分析不同時間、不同處理下各項指標的變化情況，采用Duncan’s法進行差異顯著性分析(p<0.05)。

2結果與分析

2.1α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病抑菌效果

0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g·L-1的3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙對山核桃干腐病菌的抑制率分別為12.32%、24.84%、51.79%、60.84%、63.37%。可見，α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病菌有一定的抑制作用，導致菌絲體生長緩慢提前衰退，而且隨著藥液質(zhì)量濃度的增大，抑制率也隨之增大。當藥液質(zhì)量濃度為0.10 g·L-1時對山核桃干腐病菌抑制率最大，為63.37%。經(jīng)計算得EC50為0.059 4 g·L-1，所以可選擇在藥液質(zhì)量濃度為0.06 g·L-1時對山核桃干腐病菌的抑制作用為基準，探究抑菌作用機理。

2.2α-蒎烯衍生物對菌絲體質(zhì)量及其理化性質(zhì)的影響

不同處理時間菌絲體質(zhì)量及其理化性質(zhì)變化情況如表2所示，2組菌絲體質(zhì)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，基本在96 h時，菌絲質(zhì)量同時達到最大，對照組最大可達0.027 2 g。處理組的菌絲體質(zhì)量始終小于對照組，說明該藥液對山核桃干腐病菌有一定抑制作用，菌絲體生長緩慢；隨著處理時間的增加，2組培養(yǎng)液的pH值都在相應的減小，并且減小的幅度逐漸變緩，處理120 h，pH值達到最低。處理組菌液的pH值始終明顯小于對照組，推測該病原菌受α-蒎烯衍生物藥液的作用后，可能產(chǎn)生一定量的酸性物質(zhì)致使菌液的pH值變小，并且隨著處理時間的增加，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)也隨之增多。

由表2可知，離心后上清液電導率隨著藥液作用時間的增加而增大，處理96 h，趨于穩(wěn)定，而且處理組培養(yǎng)液電導率始終高于對照組，推測培養(yǎng)液中電導率的變化可能是因為細胞膜通透性的改變，導致培養(yǎng)液中陰陽離子數(shù)目發(fā)生改變；培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)吸光值與電導率變化趨勢相似，推測該藥液破壞了山核桃干腐病的細胞膜，使細胞膜的通透性發(fā)生變化，從而導致大分子物質(zhì)外漏，并且隨著藥液處理時間的增加，大分子物質(zhì)外漏更加嚴重，導致大分子物質(zhì)的吸光值不斷增加，進而說明隨著處理時間的增加細胞膜的通透性也在增加。

2.3α-蒎烯衍生物對培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度的影響

由表2可知，隨著藥液處理時間的增加，對照組可溶性蛋白質(zhì)量濃度呈略微下降趨勢，說明山核桃干腐病在培養(yǎng)的過程中消耗了一定量的蛋白；處理組培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度不斷增加，且始終高于對照組，最高可達346.2 mg·L-1，推測該藥液對山核桃干腐病原菌的細胞膜造成破壞，細胞膜內(nèi)的蛋白外漏，從而導致培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度增加。

表2　不同處理時間菌絲體質(zhì)量、理化性質(zhì)及其可溶性蛋白質(zhì)量濃度

2.4α-蒎烯衍生物對過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響

不同質(zhì)量濃度的3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙藥液對過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性的影響如表3所示。由表3可知，經(jīng)不同質(zhì)量濃度藥液處理后，處理組培養(yǎng)液中POD和CAT活性變化明顯，隨著藥液質(zhì)量濃度的增加山核桃干腐病菌POD和CAT的活性顯著下降，表現(xiàn)顯著的抑制作用，在藥液質(zhì)量濃度為0.20 g·L-1時達到最低值，說明山核桃干腐病菌細胞內(nèi)原有的POD和CAT系統(tǒng)平衡被該藥液破壞，導致自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，活性不斷降低，從而影響細胞正常代謝，菌絲體生長受到抑制。

表3不同質(zhì)量濃度藥液對過氧化物酶和過氧化氫酶活性的影響

藥液質(zhì)量濃度/g·L-1POD/μmol·min-1·g-1對照組處理組CAT/μmol·min-1·g-1對照組處理組0 63.363.154.354.10.0462.962.353.951.20.0662.557.354.140.80.0861.955.854.331.30.1062.254.253.826.20.1562.351.754.223.10.2061.744.353.720.3

3結論與討論

山核桃干腐病是山核桃上最重要的病害，不僅影響山核桃的產(chǎn)量，而且會削弱樹勢，嚴重時則導致樹木過早死亡，生產(chǎn)中缺乏有效的防治方法[16]。本試驗選擇α-蒎烯的1種衍生物3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙處理山核桃干腐病原菌，并初步探究其作用機理。研究表明，α-蒎烯衍生物對山核桃干腐病原菌有一定抑制作用，隨著藥液質(zhì)量濃度的增加，抑制效果增強，最大抑制率為63.37%，為代替?zhèn)鹘y(tǒng)化學殺菌劑提供了可能。

菌絲體質(zhì)量、培養(yǎng)液pH值、電導率以及培養(yǎng)液中大分子物質(zhì)含量和可溶性蛋白含量均可衡量病原菌的生長情況。其中菌絲體質(zhì)量是病原菌生長是否良好的最直觀展現(xiàn)[17]。本試驗通過測定菌絲體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，處理組的菌絲體質(zhì)量始終小于對照組，由于菌絲體通過吸收培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)來生長，達到對數(shù)期后逐漸衰退，所以處理組和對照組菌絲體生長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，說明該藥液對山核桃干腐病菌產(chǎn)生一定抑制作用，導致菌絲體生長緩慢，質(zhì)量減輕；pH值是菌絲生長環(huán)境中很重要的因素，pH值反映菌液中酸堿度的高低，過低的pH值會抑制菌絲的生長[18]。本試驗發(fā)現(xiàn)，處理組菌液的pH值明顯小于對照組，說明該藥液導致培養(yǎng)基內(nèi)酸性增大或者是促進了山核桃干腐病菌的酸性次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制了菌絲正常生長；菌絲體內(nèi)電解質(zhì)對菌絲的生命活性至關重要，正常情況下，由于細胞膜作用，菌絲體細胞內(nèi)物質(zhì)不會滲漏[19]。本試驗通過測定處理組和對照組培養(yǎng)液電導率和大分子物質(zhì)含量并比較其差異，推測該藥液破壞了山核桃干腐病菌的細胞膜結構，影響菌絲體細胞膜的通透性，導致電解質(zhì)從菌絲體內(nèi)滲漏到溶液中，并且隨著處理時間的延長和藥液質(zhì)量濃度的增加，細胞內(nèi)的大分子物質(zhì)外漏加快，電導率隨之增大；蛋白質(zhì)是培養(yǎng)基內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，本試驗結果發(fā)現(xiàn)，處理組可溶性蛋白質(zhì)量濃度始終高于對照組，推測該藥液破壞山核桃干腐病菌的細胞膜，導致膜內(nèi)大量蛋白外漏，培養(yǎng)液中可溶性蛋白質(zhì)量濃度增加。

過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)屬于山核桃干腐病菌細胞內(nèi)的保護酶體系，能夠清除活性氧自由基、抵抗多種理化因子脅迫、減少活性氧積累、保持細胞膜結構的完整性，同時在阻斷自由基鏈式反應中起著至關重要的作用[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，POD和CAT活性隨著藥液質(zhì)量濃度的增加活性逐漸下降，表現(xiàn)出顯著抑制作用，再次說明3-甲氧基-4-羥基苯基-α-蒎烯馬來酰亞胺基酰腙改變了山核桃干腐病菌細胞膜的通透性，從而影響到POD和CAT活性，抑制病原菌生長。

目前，關于有效防治山核桃干腐病的方法及其作用機理研究較少，利用活性優(yōu)良的植物源殺菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學藥劑是比較理想的。本研究對α-蒎烯衍生物的作用機理進行分析，表明藥劑可能是通過改變菌絲體細胞膜的通透性，并且促進山核桃干腐病菌次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，進而抑制菌絲體生長，但是具體的作用位點和分子水平上的關系有待進一步研究。

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收稿日期：2015年12月7日。

第一作者簡介：楊洋，男，1992年1月生，東北林業(yè)大學林學院，碩士研究生。E-mail：yangyangnefu1992@163.com。通信作者：劉雪峰，東北林業(yè)大學林學院，教授。E-mail：liuxuefeng63@sina.com。

1)國家林業(yè)局“948”項目(2014-4-08)。

責任編輯：程紅。