譚　可,譚　蕾,王　瑩

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

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尿激酶對(duì)慢性青光眼大鼠視神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究

譚可,譚蕾,王瑩

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬十堰市人民醫(yī)院，湖北 十堰 442000)

[摘要]目的觀察尿激酶對(duì)慢性青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)的影響,探討其保護(hù)青光眼視神經(jīng)的作用機(jī)制。方法將36只清潔級(jí)雄性SD大鼠以隨機(jī)數(shù)字表格法分為正常組、模型組及尿激酶組，每組12只。模型組與尿激酶組大鼠均以標(biāo)準(zhǔn)鞏膜靜脈燒灼法制作高眼壓大鼠模型，使用壓平式眼壓計(jì)(美國TONO-PEN AVVI)測(cè)定大鼠的眼壓情況，在1周后眼壓趨于穩(wěn)定時(shí)，尿激酶組給予尿激酶腹腔注射，模型組與正常組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)2周。末次注射后第2天取大鼠眼球行視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞TUNEL凋亡檢測(cè)及bcl-2免疫組化檢測(cè)。結(jié)果造模成功后，尿激酶組與模型組大鼠的眼壓與術(shù)前比較均呈中度升高。正常組大鼠未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞，模型組大鼠見大量TUNEL陽性細(xì)胞，尿激酶組可見少量TUNEL陽性細(xì)胞，3組TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；正常組可見少量bcl-2陽性表達(dá)，模型組bcl-2表達(dá)明顯增強(qiáng)，尿激酶組bcl-2陽性表達(dá)增強(qiáng)最為明顯，3組bcl-2陽性表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論尿激酶可以抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)視神經(jīng)，這一過程可能是通過上調(diào)bcl-2表達(dá)來表現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞]慢性青光眼；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞；尿激酶；大鼠

青光眼是一種眼內(nèi)壓力呈現(xiàn)間斷性或者持續(xù)性升高的眼科疾病，也是目前主要致盲眼病之一，因?yàn)槠湓斐傻囊暽窠?jīng)損害是不可逆的[1]。當(dāng)前治療青光眼的主要方法是控制眼壓，但不能阻止視神經(jīng)損害的進(jìn)展，因此在降壓治療青光眼的同時(shí)如何保護(hù)視神經(jīng)一直是研究的重點(diǎn)。當(dāng)前認(rèn)為篩板區(qū)的視神經(jīng)乳頭是青光眼的原發(fā)損害點(diǎn)，該損傷會(huì)造成視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生慢性進(jìn)行性凋亡或者發(fā)生逆行性變性，因此阻滯視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡是目前保護(hù)視神經(jīng)的一個(gè)重要靶點(diǎn)[2-3]。尿激酶是最早被應(yīng)用到臨床上的溶栓藥物，毒副作用較小，用于青光眼的治療可以改善患者視力，并減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[4]，但具體的機(jī)制尚不清楚。筆者觀察了尿激酶對(duì)慢性青光眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡及bcl-2表達(dá)的影響，旨在為尿激酶的臨床應(yīng)用提供論證依據(jù)。

1實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物與分組選取健康雄性SD大鼠36只，周齡8～12周，體質(zhì)量250～300 g，均由本院動(dòng)物中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(鄂)2013-0005)，實(shí)驗(yàn)前經(jīng)檢查未發(fā)現(xiàn)大鼠有眼前節(jié)病變，眼底檢查正常，屈光間質(zhì)較為清晰。按照隨機(jī)數(shù)字表格法將36只大鼠分為正常組、高眼壓組與尿激酶組，每組12只。

1.2造模正常組不予處理，模型組與尿激酶組大鼠以標(biāo)準(zhǔn)鞏膜靜脈燒灼法制作高眼壓大鼠模型。首先腹腔注射10%的水合氯醛300 mg/kg進(jìn)行麻醉處理，隨后應(yīng)用愛爾凱因滴眼液點(diǎn)眼，共滴3次，然后順角膜緣做一放射形的切口，將外側(cè)剪開后在上方球結(jié)膜處分離肌肉與筋膜，用已經(jīng)加熱處理過的大頭針對(duì)顳上、顳下、鼻上象限2條或3條上鞏膜靜脈進(jìn)行灼燒，此時(shí)可見近端靜脈已經(jīng)充血怒張，術(shù)后對(duì)結(jié)膜囊使用氯化鈉鹽水沖洗并予以平復(fù)球結(jié)膜及涂抹紅霉素眼膏，隨后使用美國TONO-PENAVVI眼壓計(jì)測(cè)定大鼠眼壓，若大鼠眼壓在22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)以上，則可認(rèn)定造模成功。待造模大鼠高眼壓持續(xù)1周趨于穩(wěn)定后，尿激酶組給予尿激酶1 IU /只腹腔注射，正常組與模型組則給予等容量生理鹽水腹腔注射，均1次/d，共用2周。分別在造模前以及造模后1，2，3周測(cè)量3組大鼠的眼壓。

1.3視網(wǎng)膜切片的制備末次注射后第2天，腹腔注射10%的水合氯醛300 mg/kg進(jìn)行麻醉，0.5%愛爾凱因點(diǎn)眼2次，分離眼肌，立即摘除帶視神經(jīng)2 mm的眼球，使用生理鹽水沖洗，去除眼球的多余肌肉與結(jié)膜，然后將眼球放置于4%多聚甲醛溶液中，常溫固定保持2 h，再順角膜緣使用1 mL針頭打2～3個(gè)孔，石蠟包埋，同時(shí)注入一定量的固定液，保證眼球繼續(xù)固定24 h，使用鋒利的刀片順視軸方向輕柔地剖開固定好的眼球，剝掉晶狀體，用乙醇棉球填塞，并以紗布包裹好，對(duì)眼球標(biāo)本進(jìn)行梯度脫水處理，所用脫水乙醇的濃度分別為70%，80%，90%和95%，不同濃度的乙醇脫水時(shí)間均為1 h，之后使用99%濃度的乙醇脫水處理30 min，二甲苯Ⅰ透明15 min，二甲苯Ⅱ透明10 min，之后浸蠟1 h，最后予60 ℃石蠟包埋處理。

1.4視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡狀況的觀察取制備好的石蠟切片，進(jìn)行TUNEL染色，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況，每張切片隨機(jī)選取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性著色細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.5視網(wǎng)膜組織中bcl-2蛋白表達(dá)的觀察及半定量分析取免疫組化制備好的切片，高倍鏡(×400)下讀片，觀察細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜染色情況，若染成棕褐色或棕黃色即為陽性表達(dá)。使用Motic圖像系統(tǒng)對(duì)bcl-2免疫組化切片進(jìn)行圖像處理，對(duì)陽性染色細(xì)胞予以半定量分析，以平均光密度值作為bcl-2蛋白表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.13組造模前后大鼠眼壓比較造模前3組大鼠眼壓比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。造模成功后，尿激酶組與模型組大鼠眼壓均較造模前明顯升高(P均<0.05)，但組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后1周、2周、3周尿激酶組和模型組大鼠眼壓與正常組比較均明顯升高(P均<0.05)，模型組和尿激酶組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　3組造模前后眼壓比較

注:①與術(shù)前比較，P<0.05；②與正常組比較，P<0.05。

2.23組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡情況比較TUNEL陽性細(xì)胞主要存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中，在內(nèi)核與外核層很少見。其中正常組大鼠未發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜有TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，見圖1；模型組大鼠視網(wǎng)膜發(fā)現(xiàn)大量TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，(8.07±0.90)個(gè)/視野，見圖2；尿激酶組大鼠視網(wǎng)膜可見少量TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，(3.49±1.82)個(gè)/視野，見圖3。模型組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)量明顯高于尿激酶組(P<0.05)。

圖1　正常組TUNEL染色表現(xiàn)(×400)

圖2　模型組TUNEL染色表現(xiàn)(×400)

圖3　尿激酶組TUNEL染色表現(xiàn)(×400)

2.33組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2陽性表達(dá)情況比較正常組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2僅在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有少量的陽性表達(dá)，呈現(xiàn)出棕黃色散顆粒狀態(tài)，其平均光密度值為0.387±0.005， 見圖4。模型組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層上的陽性表達(dá)有所增加，bcl-2顏色加深，其平均光密度值為0.399±0.006，見圖5。尿激酶組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層上的陽性表達(dá)明顯增加，bcl-2除了顏色加深外，還可見大量塊狀表達(dá)，其平均光密度為0.443±0.005，見圖6。模型組大鼠bcl-2在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層上的陽性表達(dá)高于正常組(P<0.05)，尿激酶組則顯著高于模型組(P<0.05)。

圖4　正常組bcl-2陽性表達(dá)情況(×400)

圖5　模型組bcl-2陽性表達(dá)情況(×400)

圖6　尿激酶組bcl-2陽性表達(dá)情況(×400)

3討論

在對(duì)哺乳動(dòng)物青光眼的研究當(dāng)中，對(duì)于構(gòu)建青光眼高眼壓模型的方法有很多，例如甲基纖維素法、高滲鹽水法、透明質(zhì)酸法、血細(xì)胞法、激光誘導(dǎo)法、皮質(zhì)類固醇法等[5-6]。大量研究表明，青光眼屬于一種較為復(fù)雜的眼科疾病，因此建模就需要選擇最類似人類青光眼發(fā)病過程的方法，從而為制作與控制提供更多的方便，用大鼠制造青光眼高眼壓模型與其他動(dòng)物比較具有以下優(yōu)勢(shì)：費(fèi)用小、易于掌握；更為容易改造和繁殖，大鼠的房水外流通道與人類是相同的[7-8]。在本研究中，筆者選擇國內(nèi)外最為常用的建模方法即灼燒鞏膜靜脈法，這種方法相對(duì)簡(jiǎn)單，操作容易，眼壓也有較好地穩(wěn)定性，且并發(fā)癥較少，因此是理想的制模方法。

目前對(duì)于青光眼神經(jīng)損傷的具體機(jī)制還不夠清楚，伴隨基礎(chǔ)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)不管損傷機(jī)制是如何形成和發(fā)展的，最后都會(huì)有一個(gè)共同結(jié)局即視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，在不同動(dòng)物模型以及人類青光眼中都得到了較為充分的證實(shí)，可應(yīng)用TUNEL技術(shù)來測(cè)定細(xì)胞凋亡的情況。本研究發(fā)現(xiàn)，正常組大鼠未見TUNEL陽性細(xì)胞染色，模型組大鼠有較多的TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)，尿激酶組中也有少量的表達(dá)，模型組大鼠TUNEL陽性細(xì)胞明顯多于正常組和尿激酶組，這與文獻(xiàn)[9-11]研究報(bào)道基本一致。

bcl-2蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控有重要作用，其可以與一些細(xì)胞凋亡相關(guān)細(xì)胞結(jié)合，影響這些細(xì)胞的傳導(dǎo)通路最終達(dá)到抑制凋亡的目的[12-13]。而諸多研究也證實(shí)，通過藥物治療可調(diào)節(jié)bcl-2蛋白的表達(dá)，從而阻止視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡[14]。本研究顯示，正常組有少量bcl-2表達(dá)，模型組與尿激酶組bcl-2表達(dá)均明顯增加，且尿激酶組bcl-2表達(dá)明顯高于模型組，提示尿激酶促進(jìn)bcl-2表達(dá)上調(diào)來達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)的目的。

綜上所述，灼燒鞏膜靜脈法建模穩(wěn)定，尿激酶的使用可以減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，對(duì)視神經(jīng)有一定的保護(hù)作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)促進(jìn)bcl-2蛋白表達(dá)的上調(diào)可能是尿激酶保護(hù)慢性青光眼大鼠視神經(jīng)的機(jī)制之一。

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Study on protective mechanism of urokinase on optic nerve in rats with chronic glaucoma

TAN Ke, TAN Lei, WANG Ying

(Shiyan People’s Hospital affiliated to Hubei Medical College, Shiyan 442000, Hubei, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of urokinase on apoptosis of retinal ganglion cells and expression of bcl-2 in rats with chronic glaucoma, and to investigate the mechanism of the protective effect of the optic nerve in glaucoma. Methods Thirty-six SD male rats were selected and randomly divided into normal group, model group and urokinase group with 12 cases in each groups. The rats in model group and the urokinase group were made into high intraocular pressure model by standard scleral vein ablation method, the intraocular pressure in rats were detected by using applanation tonometer. After 1 weeks, as the intraocular pressure tends to be stable, the animals were treated with urokinase injected intraperitoneally in urokinase group, and with normal saline in the model group and normal group, consecutive 2 weeks. On the second day after the last injection, the rat eye were taken for detection of TUNEL apoptosis of retinal ganglion cells and bcl-2 immunohistochemistry. Results After successful modeling, the intraocular pressure (IOP) of rats in the urokinase group and model group showed a moderate increase compared with the preoperative. TUNEL positive cells were not found in normal rats, but a large number of TUNEL positive cells were found in the model group, a small amount of TUNEL positive cells were found in the urokinase group, there were significant differences in the expression of TUNEL positive cells between the 3 groups (all P<0.05). A small amount of bcl-2 positive expression was found in the normal group, and the expression of bcl-2 was significantly increased in the model group, the expression in the urokinase group was the most significant, there were significant differences positive expression of bcl-2 between the 3 groups (all P<0.05). Conclusion Urokinase can inhibit the apoptosis of retinal ganglion cells, so as to protect the optic nerve, this process could be expressed by up regulating bcl-2 expression.

Key words:chronic glaucoma; retinal ganglion cells; urokinase; rat

[收稿日期]2015-11-10

[中圖分類號(hào)]R-332

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1008-8849(2016)15-1626-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.009

[作者簡(jiǎn)介]譚可，女，主治醫(yī)師，從事眼視光及青光眼疾病研究。[通信作者]王瑩，E-mail:wangying19810214@163.com