黃　通，溫　琪，王長義，彭曉琳，張春惠，劉盛元，李克深

(1.深圳市南山區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳　518054；2.廣東省衰老相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江　524001)

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臨床醫(yī)學(xué)研究

RAGE基因多態(tài)性與阿爾茨海默病在中國漢族人群中的相關(guān)性研究

黃通1，溫琪1，王長義1，彭曉琳1，張春惠1，劉盛元1，李克深2

(1.深圳市南山區(qū)慢性病防治院，廣東 深圳518054；2.廣東省衰老相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江524001)

[摘要]目的 探討在中國漢族人群中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體基因多態(tài)性與阿爾茨海默病發(fā)生的關(guān)系。方法 采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)，確定70例AD患者和67例對(duì)照進(jìn)行研究，對(duì)受試者外周靜脈血提取全血DNA，通過PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量測序的方法檢測兩組樣本RAGE基因多態(tài)性，比較其基因型的分布情況。結(jié)果 rs1800624位點(diǎn)的多態(tài)性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD組AA基因型頻率(50%)和A等位基因頻率(61.43%)分別明顯高于對(duì)照組的(1.49%)和(13.43%)，AA基因型患AD的風(fēng)險(xiǎn)是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的風(fēng)險(xiǎn)分別是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；有A等位基因能夠明顯增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)；rs1800625位點(diǎn)的多態(tài)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 在中國漢族人群中，rs1800624位點(diǎn)與AD的發(fā)生相關(guān)，A等位基因可能是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

[關(guān)鍵詞]阿爾茨海默病；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；單核甘酸多態(tài)性

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要臨床表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙和認(rèn)知功能障礙，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為能力減退，是癡呆最常見的類型[1]。2010年全球約有AD患者3500萬，到2050年將達(dá)到1.15億[2]。AD發(fā)病率高、患病率高、致殘率高的特點(diǎn)是其成為全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[3]。探討AD發(fā)病機(jī)理和影響因素，對(duì)早期發(fā)現(xiàn)易患人群給予重點(diǎn)防治，提高老年人生活質(zhì)量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)具有重要意義。

晚期糖基化終末產(chǎn)物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)受體屬于免疫球蛋白家族。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，RAGE主要在神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，同時(shí)RAGE可以與多種與AD有關(guān)的分子(β-淀粉樣蛋白、晚期糖基化終末產(chǎn)物和S100/鈣粒蛋白)結(jié)合[4-5]，說明RAGE在AD的病理發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用，但是目前沒有研究報(bào)道從分子流行病學(xué)角度闡述RAGE基因rs1800624和rs1800625位點(diǎn)多態(tài)性與AD的關(guān)系，因此本文探討了其與AD的關(guān)聯(lián)性，為臨床診斷和治療AD提供理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象納入與排除標(biāo)準(zhǔn)AD患者均經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)檢查，包括詳細(xì)的病史采集、全面體格檢查以及神經(jīng)系統(tǒng)檢查、實(shí)驗(yàn)室篩查實(shí)驗(yàn)、認(rèn)知功能評(píng)估、頭部核磁共振成像或CT檢查，從深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院和石巖敬老院選取符合精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(DSM-IV)和美國國立神經(jīng)病、語言交流障礙和卒中研究所—老年性癡呆及相關(guān)疾病學(xué)會(huì)(NINCDS-ADRDA)標(biāo)準(zhǔn)[6]的單純AD病例。

排除標(biāo)準(zhǔn)：有血管性和“混合”老年癡呆癥、神經(jīng)性疾病、癌癥、糖尿病、高血壓和心腦血管疾病的對(duì)象均被排除在外。同時(shí)，在深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院和石巖敬老院中選取臨床、心理和神經(jīng)學(xué)評(píng)估均正常的人作為對(duì)照組，以上所有研究對(duì)象均為漢族。該項(xiàng)研究已得到倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究人員對(duì)每個(gè)入選對(duì)象都要進(jìn)行詳細(xì)的研究說明并由入選對(duì)象簽署一份書面的知情同意書。

1.2實(shí)驗(yàn)研究方法

1.2.1基因組DNA的提取將200 μL EDTA-K2抗凝全血于3 000 rpm離心20 min，棄去血漿，按照QIAamp DNA Blood Mini Kit(QIAGEN)試劑盒使用說明書提取基因組DNA，取5 μL提取產(chǎn)物進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL溴化乙錠)電泳鑒定，以DNA Marker DL2000作為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，在紫外燈下觀察產(chǎn)物電泳結(jié)果，其余置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2基因型的檢測RAGE基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)選擇標(biāo)準(zhǔn)：①公開發(fā)表文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫中的SNPs位點(diǎn)；②在流行病學(xué)研究中報(bào)道過的與疾病相關(guān)的SNPs位點(diǎn)；③SNPs位點(diǎn)的次要等位基因頻率>0.1。根據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，本文選擇了位于RAGE基因啟動(dòng)子區(qū)域的rs1800624和rs1800625兩個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行研究。應(yīng)用Primer premier 5引物設(shè)計(jì)軟件在多態(tài)性位點(diǎn)附近100bp左右區(qū)域設(shè)計(jì)引物，將其序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，確定引物特異性，最后引物序列由深圳華因康公司合成。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 X Taq Unicorn Premix 10 μL，引物P1、P2各0.3 μL(10 μmol/L)，基因組DNA模板1 μL(25 ng/μL)，ddH2O 8.4 μL，共20 μL體系。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃變性4 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性20 s，57 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，20個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸3 min，最后置于4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增完畢后，為了獲取大量目的片段取1 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，稀釋10倍后作為反應(yīng)模板，再行另一次PCR擴(kuò)增，除模板PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系同上。以上2次PCR產(chǎn)物取5μL加入上樣緩沖液1 μL，180 V電壓12%PAGE凝膠電泳20 min，紫外成像儀檢測電泳結(jié)果并拍照。對(duì)擴(kuò)增的片段中的單核苷酸多態(tài)性采用PSTAR-II plus(IDN01-M-P2)高通量測序的方法檢測。

2結(jié)果

2.1一般情況AD組共有70例，其中男性42(60%)例，女性28(40%)例，年齡為75.5(68，78)歲；對(duì)照組共有67例，其中男性32(47.76%)例，女性35(52.24%)例，年齡為72(68，76)歲，年齡和性別構(gòu)成在兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性(見表1)。

表1AD組和對(duì)照組的年齡和性別情況

組別例數(shù)年齡(歲)性別(男/女)AD組7075.5(68,78)42/28健康對(duì)照組6772.0(68,76)32/35P0.17150.1508

2.2rs1800624和rs1800625位點(diǎn)的HWE檢驗(yàn)和連鎖不平衡分析rs1800624和rs1800625位點(diǎn)的HWE檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩位點(diǎn)在對(duì)照組中的基因型頻率均符合HWE，只有rs1800624位點(diǎn)在AD組中的基因型頻率不符合HWE，表明AD組可能發(fā)生了明顯的rs1800624位點(diǎn)突變(見表2)。

兩位點(diǎn)的連鎖不平衡分析結(jié)果為χ2=3.579 0，P=0.058 5，表明兩位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡關(guān)系，彼此相對(duì)獨(dú)立。

表2rs1800624和rs1800625位點(diǎn)的HWE檢驗(yàn)結(jié)果

分組SNPIDChi-SquareDFPAD組rs180062418.75781<0.0001rs18006252.234510.1350對(duì)照組rs18006240.048210.8262rs18006250.038910.8437

2.3rs1800624和rs1800625位點(diǎn)的基因型和等位基因分布情況AD組與對(duì)照組rs1800624和rs1800625位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分析結(jié)果顯示：rs1800624位點(diǎn)的多態(tài)性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，AD組AA基因型頻率(50%)和A等位基因頻率(61.43%)分別明顯高于對(duì)照組的(1.49%)和(13.43%)，與AD的發(fā)生相關(guān)；rs1800625位點(diǎn)的多態(tài)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與AD的發(fā)生不存在相關(guān)性(見表3)。

表3rs1800624和rs1800625的基因型和等位基因分布情況

SNPID基因型/等位基因AD組對(duì)照組n(%)n(%)Chi-SquarePrs1800624AA35(50.00)1(1.49)44.53<0.0001AT16(22.86)16(23.88)TT19(27.14)50(74.63)A86(61.43)18(13.43)66.97<0.0001T54(38.57)116(86.57)rs1800625CC2(2.86)1(1.49)0.580.7482CT11(15.71)13(19.40)TT57(81.43)53(79.10)等位基因C15(10.71)15(11.19)0.020.8988T125(89.29)119(88.81)

2.4多因素logistic回歸分析以是否患AD為因變量，年齡、性別和rs1800624和rs1800625的位點(diǎn)多態(tài)性(設(shè)置啞變量)為自變量進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸，變量選入和剔除水平均為0.05，結(jié)果顯示最后納入方程的因素只有rs1800624位點(diǎn)多態(tài)性，rs1800624位點(diǎn)AA基因型患AD的風(fēng)險(xiǎn)是AT基因型的34.994倍(OR=34.994，95%CI：4.264～287.179)；AA和AT基因型患AD的風(fēng)險(xiǎn)分別是TT基因型的92.089倍(OR=92.089，95%CI：11.777～720.070)和2.632倍(OR=2.632，95%CI：1.101～6.290)；A等位基因能夠明顯增加AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=7.895，95%CI：3.686～16.911)。

3討論

隨著全球人口老齡化，AD發(fā)病率和患病率呈逐年顯著上升趨勢(shì)，但其確切發(fā)病機(jī)制目前還尚未闡明，臨床上亦無特效治療方法，尋找特異敏感的生物學(xué)標(biāo)志，運(yùn)用多種手段防治AD，具有深遠(yuǎn)的意義[7]。一般認(rèn)為AD是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而遺傳因素在AD的發(fā)病中起重要作用[8]。Alberti KG等人研究表明載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)是AD的主要遺傳風(fēng)險(xiǎn)因子[9]，但值得注意的是有50%散發(fā)AD患者并不攜帶ApoE，提示還存在其它遺傳危險(xiǎn)因子。

β-淀粉樣蛋白形成淀粉樣斑塊和微管相關(guān)蛋白tau基因高度磷酸化后形成螺旋纖維絲是AD的主要病理學(xué)特征[10-11]。RAGE作為普遍存在于神經(jīng)系統(tǒng)的膜受體，可以介導(dǎo)β-淀粉樣蛋白透過血腦屏障，活化小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致產(chǎn)生氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎癥病理反應(yīng)并進(jìn)一步反饋上調(diào)自身表達(dá)，所造成的神經(jīng)損傷與AD發(fā)病直接相關(guān)[12]，可見，RAGE與AD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是目前從分子流行病學(xué)角度闡述RAGE基因與AD關(guān)系的研究較少。

人類RAGE基因位于6號(hào)染色體6p21.3，含有11個(gè)外顯子和1個(gè)長約1.7kb的5′側(cè)域，位于主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ型分子與Ⅲ型分子的基因之間。Li K等人研究發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中RAGE基因rs2070600(G82S)位點(diǎn)多態(tài)性與AD的易感性有關(guān)，S等位基因可能是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且在正常人群中，中國漢族人群的S等位基因頻率高于高加索人、韓國人和日本人，表現(xiàn)出明顯的種族差異[13]。Daborg J等人研究的結(jié)果顯示在歐洲人群中RAGE基因rs2070600位點(diǎn)突變的S等位基因會(huì)增加AD的易感性[14]。Hudson BI等人研究發(fā)現(xiàn)位于RAGE基因啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)區(qū)域中的rs1800624(-374T/A)和rs1800625(-429T/C)位點(diǎn)能顯著增強(qiáng)RAGE基因的轉(zhuǎn)錄活性，且與2型糖尿病及其并發(fā)癥相關(guān)聯(lián)[15]。但是目前沒有rs1800624和rs1800625位點(diǎn)多態(tài)性與AD發(fā)生關(guān)系的研究報(bào)道，故本研究探討了其與AD發(fā)生的關(guān)聯(lián)性。

本研究結(jié)果顯示在中國漢族人群中，rs1800624位點(diǎn)在AD組中的基因型頻率不符合HWE，突變的A等位基因型頻率(61.43%)高于野生的T等位基因型頻率，Salanti G等人研究認(rèn)為病例組基因型頻率因?yàn)楣δ苌鲜艿竭x擇壓力(疾病也算是一種選擇壓力)可能不符合HWE[16]；RAGE基因rs1800624位點(diǎn)多態(tài)性與AD的發(fā)生有密切的關(guān)聯(lián)，A等位基因可能是AD發(fā)生的危險(xiǎn)因素，這可能有助于評(píng)估個(gè)體的易感性，探索疾病預(yù)防控制的有效措施。

由于本研究只有137名研究對(duì)象，不能排除存在對(duì)結(jié)果的過高估計(jì)或者未能檢測出較弱的相關(guān)性現(xiàn)象(如rs1800625位點(diǎn)的多態(tài)性是否與AD的發(fā)生相關(guān))，在后續(xù)的研究中，需要進(jìn)行大樣本、多地區(qū)和多民族的研究，同時(shí)應(yīng)納入更多的有功能意義的多態(tài)性位點(diǎn)，開展更為全面深入地探討。

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[收稿2016-03-02;修回2016-03-28]

(編輯：王福軍)

Correlation study between gene polymorphism of RAGE and Alzheimer's disease in a Chinese Han population

HuangTong1,WenQi1,WangChangyi1,PengXiaolin1,ZhangChunhui1,LiuShengyuan1,LiKeshen2

(1.Nanshan Center for Chronic Disease Control of Shenzhen, Shenzhen Guangdong 518054, China;2.Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac and Cerebral Diseases,Zhanjiang Guangdong 524001,China)

[Abstract]Objective To examine the relationship between the receptor for advanced glycation end-products (RAGE) gene polymorphism and Alzheimer's disease in a Chinese Han population.Methods This is a case-control study. A total of 70 patients with Alzheimer's disease and 67 control subjects were included in this study. DNA was extracted directly from peripheral venous blood samples. PSTAR-II plus (IDN01-M-P2) detection technologies were used to identify single nucleotide polymorphism (SNP) distribution of RAGE gene loci. Genotype and allele frequency differences were analyzed and compared between the two groups.Results There was a significant difference in genotype frequency distribution of the rs1800624 loci. The patients with Alzheimer's disease had an obviously higher frequency of AA genotype (50%) and A allele (61.43%) than control subjects (1.49% and 13.43%). Alzheimer’s disease risk in rs1800624 AA genotype carriers was 34.994 times (OR=34.994, 95%CI:4.264～287.179) more than that in AT genotype carriers and AA/AT genotype carriers was 92.089 times (OR=92.089, 95%CI:11.777～720.070) and 2.632 times (OR=2.632, 95%CI:1.101～6.290) more than that in TT genotype carriers, respectively. A allele significantly increased the risk of Alzheimer's disease (OR=7.895，95%CI：3.686～16.911). However, no significant difference was found in genotype frequency distribution of the rs1800625.Conclusion RAGE gene in rs1800624 shows a strong relationship with Alzheimer’s disease. A allele could be a risk factor for Alzheimer's disease in Chinese Han population.

[Key words]Alzhemer's disease; receptor for advanced glycation end products; single nucleotide polymorphism

[中圖法分類號(hào)]R592

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0158-04

[通信作者]劉盛元，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：慢性非傳染性疾病預(yù)防與控制，E-mail:liushenglb@126.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81302482)；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：2015A030313767)；廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(NO：A2015387)。