楊加偉，龍朝康，張海橋，葛正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

塊莖特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的hIL-12在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)

楊加偉，龍朝康，張海橋，葛正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)教研室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 檢測(cè)人白細(xì)胞介素-12(hIL-12)蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中的表達(dá)量、遺傳穩(wěn)定性以及組織特異性。方法 提取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖與葉片總蛋白，利用hIL-12抗體進(jìn)行western blot和ELISA檢測(cè)。結(jié)果 在5株轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的塊莖中檢測(cè)到了hIL-12蛋白的表達(dá)，表達(dá)量最高達(dá)到3.04 μg/g(總蛋白)。此外，同一植株的多個(gè)塊莖中hIL-12的表達(dá)具有一致性，而在葉片中未檢測(cè)到明顯的表達(dá)。選取2株馬鈴薯植株的塊莖進(jìn)行種植，其后代也能檢測(cè)到穩(wěn)定的hIL-12蛋白表達(dá)。結(jié)論 本研究獲得了穩(wěn)定高表達(dá)hIL-12蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，為利用馬鈴薯生物反應(yīng)器高效表達(dá)生產(chǎn)hIL-12蛋白提供了理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]人白細(xì)胞介素-12；蛋白表達(dá)；植物生物反應(yīng)器；Ppatatin啟動(dòng)子

人白細(xì)胞介素-12(hIL-12)是一種大小約為75 kD，由單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞分泌的糖蛋白細(xì)胞因子，由1個(gè)約35 kD的小亞基和1個(gè)約40 kD的大亞基通過二硫鍵連接[1]。它的生物學(xué)功能包括增強(qiáng)細(xì)胞毒性反應(yīng)；誘導(dǎo)INF-γ、IL-2及腫瘤壞死因子TNF-α的生成；以及抗血管生成和抗腫瘤效應(yīng)等[1-2]。此外，IL-12還被用作佐劑和某些抗原共同注射以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的免疫力[3]，在臨床上將有著廣闊的應(yīng)用前景。植物生物反應(yīng)器具有操作簡(jiǎn)便、產(chǎn)物活性高、成本低、易擴(kuò)大規(guī)模等優(yōu)點(diǎn)，利用植物生物反應(yīng)器高效表達(dá)生產(chǎn)IL-12，降低IL-12的生產(chǎn)成本，具有重大的應(yīng)用價(jià)值[4]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究中，構(gòu)建了馬鈴薯塊莖特異性啟動(dòng)子Ppatatin驅(qū)動(dòng)的hIL-12表達(dá)載體并導(dǎo)入馬鈴薯基因組，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株[5-6]。因此，本研究接下來對(duì)陽性轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中hIL-12在蛋白水平的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，為利用馬鈴薯高效表達(dá)生產(chǎn)hIL-12蛋白提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑本研究用轉(zhuǎn)基因馬鈴薯材料由本實(shí)驗(yàn)室前期研究獲得[6]。主要試劑有人hIL-12抗體(Abcam公司)，HRP標(biāo)記二抗(碧云天生物技術(shù)公司)、化學(xué)發(fā)光試劑盒(Bio-Rad公司)、SDS-PAGE凝膠試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、hIL-12 ELISA試劑盒(生工生物工程上海股份有限公司)等。

1.2馬鈴薯塊莖總蛋白提取切取馬鈴薯塊莖約0.5 g，加入3 mL總蛋白提取液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.5，50 mmol/L EDTA，0.5% SDS，1%蛋白酶抑制劑)，冰上研磨至勻漿，12 000 r/min 離心10 min，收集上清液利用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后保存。

1.3Western blot分析Western blot方法參考文獻(xiàn)[7]并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)。配制濃度為12%的SDS-PAGE凝膠，將處理后的蛋白樣品點(diǎn)入上樣孔進(jìn)行電泳。電泳完畢后按照“濾紙-凝膠-硝酸纖維膜-濾紙”從負(fù)極到正極的順序進(jìn)行組裝置于電轉(zhuǎn)儀中，恒流200 mA轉(zhuǎn)移1～2 h。將膜用TBS清洗1次(5 min)，浸入5%脫脂奶粉(TBS溶解)中37 ℃封閉1 h后，將膜取出，TBS清洗1次(5 min)；在5%脫脂奶粉(TBS溶解)中按照1∶2 000的稀釋比例加入一抗，膜浸入其中，37 °C孵育1 h；將雜交膜1×TTBS清洗5次，每次5 min；在5%脫脂奶粉中按照1∶5 000的稀釋比例加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)，將膜浸入其中，37 °C孵育1 h；1×TTBS清洗5次，每次5 min，1×TBS洗15 min；利用化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行發(fā)光后利用化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)進(jìn)行曝光照相。

1.4ELISA分析將待測(cè)樣品稀釋50倍后用人IL-12 Elisa檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中hIL-12的含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。主要步驟包括：將蛋白質(zhì)樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣)、生物素標(biāo)記抗體及酶試劑加入hIL-12包被的酶標(biāo)板，混勻后37 ℃保溫1 h，洗板后加入顯色液，5 min后加入終止液于450 nm測(cè)量OD值。

2結(jié)果

2.1hIL-12蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中的表達(dá)在前期研究中，獲得了大量Ppatatin驅(qū)動(dòng)的hIL-12轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株，RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示其中有7株轉(zhuǎn)基因植株的塊莖中檢測(cè)到了hIL-12 mRNA的表達(dá)[6]。本研究接下來提取這7個(gè)植株塊莖中的總蛋白，利用hIL-12抗體進(jìn)行western blot檢測(cè)hIL-12在蛋白水平的表達(dá)情況。結(jié)果(見圖1B)顯示：其中的3、8、9、10、11號(hào)5個(gè)植株塊莖能明顯檢測(cè)到hIL-12蛋白表達(dá)，另外的7號(hào)和12號(hào)植株塊莖未檢測(cè)到明顯信號(hào)(見圖1A)。本研究進(jìn)一步利用ELISA技術(shù)對(duì)hIL-12蛋白的表達(dá)進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果與western blot實(shí)驗(yàn)一致，除7號(hào)和12號(hào)植株外，其余5個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的塊莖中均檢測(cè)到明顯的蛋白表達(dá)，表達(dá)量為1.0～3.1 μg/g(總蛋白)，和野生型植株相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(見圖1B)。其中，3號(hào)植株的馬鈴薯塊莖hIL-12表達(dá)量最高，達(dá)到(3.04±0.11) μg/g(總蛋白)。

“-”和“+”分別表示野生型材料陰性對(duì)照和hIL-12重組蛋白陽性對(duì)照，其余編號(hào)表示不同的陽性單株塊莖；*表示與陰性對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。　　圖1　Western blot(A)和ELISA(B)方法檢測(cè)hIL-12蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中的表達(dá)

2.2hIL-12蛋白表達(dá)的一致性與組織特異性檢測(cè)為檢測(cè)外源基因在同一植株所有后代中的表達(dá)量是否具有一致性，從表達(dá)量最高的3號(hào)植株和表達(dá)量最低的8號(hào)植株中各挑取6個(gè)馬鈴薯薯球進(jìn)行ELISA檢測(cè)，結(jié)果表明，所有的12個(gè)薯球中均檢測(cè)到hIL-12蛋白表達(dá)(見圖2A)。其中，3號(hào)植株的6個(gè)馬鈴薯塊莖中hIL-12的表達(dá)量為2.9～3.3 μg/g(總蛋白)， 8號(hào)植株的6個(gè)馬鈴薯塊莖中hIL-12的表達(dá)量為0.9～1.1 μg/g(總蛋白)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示：3號(hào)植株不同馬鈴薯塊莖中的蛋白表達(dá)量除了3-4和3-5間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P<0.05)，其余塊莖蛋白表達(dá)量無差異(P>0.05)；而8號(hào)植株的6個(gè)馬鈴薯塊莖中hIL-12蛋白的表達(dá)差異也和3號(hào)植株類似，僅8-2和8-6間有差異(P<0.05)。以上結(jié)果表明hIL-12蛋白在同一植株不同后代中的表達(dá)基本具有一致性。由于本研究中驅(qū)動(dòng)hIL-12基因表達(dá)的啟動(dòng)子為塊莖特異性啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子在馬鈴薯其它組織中幾乎不表達(dá)。為檢測(cè)hIL-12蛋白的表達(dá)是否也具有組織特異性，本研究對(duì)在塊莖中能檢測(cè)出hIL-12蛋白表達(dá)的5個(gè)植株的葉片進(jìn)行western blot和ELISA檢測(cè)。Western blot顯示，在這5個(gè)植株的葉片中均未檢測(cè)到蛋白表達(dá)信號(hào)(見圖2B)。同時(shí)，ELISA實(shí)驗(yàn)顯示，8號(hào)和10號(hào)植株葉片中hIL-12蛋白的表達(dá)與野生型植株無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而3、9、11這3株植株葉片中雖然能檢測(cè)到hIL-12蛋白的表達(dá)，但其hIL-12表達(dá)量極低，每克總蛋白中hIL-12的表達(dá)量均小于0.35 μg(見圖2C)，遠(yuǎn)低于其在塊莖中的表達(dá)量，初步表明hIL-12蛋白的表達(dá)具有塊莖組織特異性。

2.3hIL-12蛋白表達(dá)遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)選取hIL-12蛋白表達(dá)量較高的3號(hào)和9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的塊莖進(jìn)行種植并獲得其子代馬鈴薯塊莖。從這2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中隨機(jī)取4株子代植株的塊莖，提取其總蛋白后利用western blot和ELISA檢測(cè)hIL-12在轉(zhuǎn)基因后代中的表達(dá)情況。Western blot結(jié)果顯示，所有的8個(gè)樣品中均檢測(cè)到了hIL-12蛋白的表達(dá)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果和western blot一致，大部分子代植株中hIL-12蛋白的表達(dá)量和親代相近，與野生型植株相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。本實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因植株在經(jīng)過一次繁殖后，外源基因的表達(dá)穩(wěn)定(見圖3)。

A：ELISA檢測(cè)3號(hào)和8號(hào)植株不同塊莖中hIL-12的表達(dá)±s，n=3)；“-”表示野生型材料陰性對(duì)照，3-1至3-6表示3號(hào)轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的不同塊莖，8-1至8-6表示8號(hào)轉(zhuǎn)基因植株所結(jié)的不同塊莖。字母表示在0.05水平上的差異顯著性。B：Western blot檢測(cè)hIL-12蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片中的表達(dá)；“-”和“+”分別表示野生型材料陰性對(duì)照和hIL-12重組蛋白陽性對(duì)照，其余編號(hào)表示不同的陽性單株塊莖。C：ELISA檢測(cè)hIL-12蛋白在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株葉片中的表達(dá)±s，n=3)，編號(hào)含義同圖2B，*表示與陰性對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。圖2　hIL-12蛋白表達(dá)的一致性與組織特異性檢測(cè)

A：Western blot檢測(cè)hIL-12蛋白在3號(hào)和9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株后代塊莖中的表達(dá)；B：ELISA檢測(cè)hIL-12蛋白在3號(hào)和9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株后代塊莖中的表達(dá)±s，n=3)?！?”和“+”分別表示野生型材料陰性對(duì)照和hIL-12重組蛋白陽性對(duì)照，3-1至3-4和9-1至9-4分別表示3號(hào)與9號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的后代，*表示與陰性對(duì)照相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。圖3　hIL-12蛋白在轉(zhuǎn)基因植株后代中的表達(dá)檢測(cè)

3討論

目前，利用外源重組表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的生物技術(shù)藥物已在癌癥、心腦血管疾病、糖尿病等重大疾病的治療方面起著舉足輕重的作用[8]。自1998年Magnuson等[9-10]首次報(bào)道用煙草懸浮細(xì)胞表達(dá)了具有活性的人IL-2和IL-4[11]以來，現(xiàn)已有多種白細(xì)胞介素先后在植物中成功表達(dá)。相比于工業(yè)上常用的微生物反應(yīng)器和動(dòng)物反應(yīng)器，植物由于具有細(xì)胞培養(yǎng)簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)基因體系成熟、與動(dòng)物細(xì)胞相似的真核基因表達(dá)機(jī)制等各種優(yōu)越性，使得開發(fā)植物生物反應(yīng)器表達(dá)具有應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用潛力的藥用蛋白受到了許多科研工作者的重視[12-13]。而馬鈴薯由于具有遺傳轉(zhuǎn)化體系完善、轉(zhuǎn)化周期較短、無性繁殖技術(shù)成熟、生長(zhǎng)容易及產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)，被廣泛用來進(jìn)行藥用蛋白表達(dá)研究[10,14]。

但是，相比于微生物反應(yīng)器的高效性，植物表達(dá)系統(tǒng)的外源蛋白表達(dá)量太低[10-11]，大大限制了其發(fā)展。Gutiérrez-Ortega等[15]早在2004年便在煙草中成功表達(dá)了具有生物學(xué)活性的hIL-12蛋白，但表達(dá)量?jī)H為30 ng/g(鮮重)；在本實(shí)驗(yàn)室的前期研究中，利用組成型的CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)hIL-12基因在馬鈴薯中表達(dá)，獲得了具有生物學(xué)活性的重組蛋白，但表達(dá)量非常低[16-17]。因此，如何提高外源蛋白在植物中的表達(dá)量引起不少研究者的關(guān)注。啟動(dòng)子是決定外源蛋白能否高表達(dá)的重要因素，而選擇利用組織特異性的強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源基因，在植物的某一特定組織內(nèi)獲得高表達(dá)重組蛋白，是優(yōu)化植物生物反應(yīng)器的途徑之一。如：Park等[10]利用Ppatatin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)白介素-2(IL-2)蛋白的表達(dá)，表達(dá)量得到大大提高，最高可達(dá)到約110 μg/g(總蛋白)。馬鈴薯的PATATIN蛋白是一類分子量約為40 kD的糖蛋白，其在塊莖可溶性總蛋白中的含量高達(dá)40%，而在其它組織中的含量極少[18]，因此本研究選擇了該基因的啟動(dòng)子Ppatatin來驅(qū)動(dòng)hIL-12基因的表達(dá)。本研究將前期實(shí)驗(yàn)得到的7個(gè)陽性轉(zhuǎn)基因馬鈴薯株系進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)，western blot和ELISA實(shí)驗(yàn)均表明，其中的5個(gè)植株在蛋白水平有大量的表達(dá)，在每克總蛋白中hIL-12蛋白的表達(dá)量可超過3 μg，外源蛋白的表達(dá)量相比前期研究大大提高[16]。此外，在隨機(jī)選擇的2個(gè)植株不同塊莖中均能檢測(cè)到一致的hIL-12蛋白表達(dá)，初步表明同一株植株不同塊莖中外源蛋白的表達(dá)具有一致性。

由于植物基因組遺傳的復(fù)雜性，外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的遺傳穩(wěn)定性頗受關(guān)注，而藥用蛋白基因的遺傳穩(wěn)定性是影響植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)效率的決定因素之一[19]。由于馬鈴薯的繁殖方式以無性繁殖為主，因此選擇馬鈴薯作為生物反應(yīng)器也可以在一定程度上避免因有性繁殖帶來的遺傳穩(wěn)定性問題。為驗(yàn)證本研究實(shí)驗(yàn)材料的遺傳穩(wěn)定性，選擇了部分轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行種植，并對(duì)后代hIL-12的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有的實(shí)驗(yàn)材料均能檢測(cè)到hIL-12蛋白的表達(dá)，初步表明本研究的外源基因在馬鈴薯植株中的表達(dá)具有非常好的遺傳穩(wěn)定性。

總之，本研究對(duì)前期獲得的Ppatatin驅(qū)動(dòng)的hIL-12轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中hIL-12蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并檢測(cè)了蛋白表達(dá)的遺傳穩(wěn)定性，最終獲得了能穩(wěn)定遺傳的表達(dá)hIL-12蛋白的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。本研究對(duì)馬鈴薯生物反應(yīng)器在藥用蛋白表達(dá)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2016-01-04;修回2016-02-16]

(編輯：王靜)

Expression of human IL-12 driven by tuber specific promoter in transgenic potato (Solanumtuberosum)

YangJiawei,LongChaokang,ZhangHaiqiao,GeZhenglong

(Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To detect the expression level, genetic stability and tissue specificity of human IL-12 (hIL-12) in transgenic potato plants.Methods Total proteins were extracted from tubers and leaves of transgenic potato plants. Then, western blot and ELISA techniques were used to detect the expression of hIL-12.Results The hIL-12 was expressed in 5 transgenic potato plants with the maximal accumulation of approximately 3.04 μg/g total proteins in the tubers. Furthermore, the expression of hIL-12 in different tubers from 1 transgenic plant was consistent, while rarely hIL-12 expression was detected in leaves of transgenic potato plants.Conclusion Transgenic potato plants expressing hIL-12 with high level and stability were obtained in this study, which providing fundamental basis for efficient production of hIL-12 in potato bioreactor.

[Key words]human IL-12; protein expression; plant bioreactor; promoter patatin

[中圖法分類號(hào)]Q786

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0134-05

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：31460230)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO: 黔科合J字[2013]2324)；遵義醫(yī)學(xué)院博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(NO: F-587)。