李金芳，宋百靈，3，張　唯，李新霞，2*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊　830011；2.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，烏魯木齊　830011；3.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊　830011)

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一測多評法測定天然辣椒堿中2種主要成分

李金芳1，宋百靈1，3，張唯1，李新霞1，2*

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學中心實驗室，烏魯木齊830011；3.新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊830011)

摘要：目的建立以1種對照品同時測定天然辣椒堿中2種成分的質量評價方法。方法以辣椒辣素為對照，采用一測多評法，同時測定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量。結果測得辣椒辣素與二氫辣椒辣素的相對校正因子為1.12，同時采用外標法和一測多評法測定樣品中二氫辣椒辣素含量，采用t檢驗對二者測定值進行比較，二者之間無顯著差異(P>0.05)；以辣椒辣素的保留時間為1.00，計算得二氫辣椒辣素的相對保留時間為1.355，相對保留時間及保留時間差的RSD均小于5%。結論采用一測多評法，以辣椒辣素為對照，利用相對校正因子可實現(xiàn)同時測定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量。

關鍵詞：辣椒辣素；二氫辣椒辣素；一測多評；HPLC；校正因子

辣椒堿類化合物(capsaicinoids)是辣椒的標志性成分，包括辣椒辣素、二氫辣椒辣素、降二氫辣椒辣素、高二氫辣椒辣素和高辣椒辣素等[1]。其中辣椒辣素和二氫辣椒辣素約占辣椒堿總量的90%[2]，二者含量因品種、產(chǎn)地、栽培環(huán)境的不同而存在差異，因此，辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量是辣椒品質評定的重要指標。

辣椒辣素(capsaicin)化學名為8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是一種含酚羥基的生物堿[3]，二氫辣椒辣素(dihydrocapsaicin，DHC)是辣椒辣素的氫化產(chǎn)物，二者含量高低影響其辣度。辣椒堿類化合物的主要藥效有鎮(zhèn)痛[4]、止咳[5]、抗疲勞、抗炎、殺菌、抗病毒[6-7]及對心血管和消化系統(tǒng)的保護作用等。近年來，研究發(fā)現(xiàn)高純度的辣椒堿可以殺死癌細胞，減少細胞癌變[8-9]；高純辣椒堿可以制成戒毒藥物[10]。

天然藥物有效成分多為類群，類群成分間存在某些內(nèi)在關聯(lián)，2006年，王智民等首次提出并建立了適合于中藥特點的一測多評測定法(quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS)。一測多評法[11]：在一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質量或濃度)與響應值成正比，使用多指標質量評價時，以樣品中某一典型組分(易得、廉價、有效)為對照，建立其與其他組分(對照品難獲得、不穩(wěn)定或價格昂貴)的相對校正因子，依據(jù)相對校正因子推算樣品中其他組分含量，并使其計算值與實測值符合定量方法學要求的一種方法。一測多評法已被2010年版《中國藥典》收錄，在多種中藥質量評價研究中得到應用[12-14]。

美國藥典收載了辣椒堿提取物、辣椒、辣椒油3個品種，分別以辣椒辣素、二氫辣椒辣素為對照品，采用HPLC法進行含量測定[15]。歐盟藥典收載了辣椒、辣椒油、辣椒流浸膏、辣椒酊劑4個品種，均以辣椒辣素為對照品，采用HPLC法，測定總辣椒堿含量[16]?！吨袊幍洹肥蛰d了辣椒品種，分別以辣椒辣素、二氫辣椒辣素為對照品，采用HPLC法測定總辣椒堿含量[17]。

本實驗擬以辣椒辣素為對照品參考美國藥典中辣椒堿的含量測定方法，采用一測多評法測定兩者之間的相對校正因子，推算二氫辣椒辣素的含量，用于辣椒堿類物質的質量評價。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(1260，安捷倫科技有限公司)；分析天平(AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-Teledo集團)；超低有機物超純水機(Milli-Q Reference，密理博中國有限公司)。

1.2試藥辣椒堿(capsaicin，北京百靈威科技有限公司，質量分數(shù)為99%，批號LF400122)；二氫辣椒堿(dihydro capsaicin，質量分數(shù)為96%，批號1-LIV-100-1)；天然辣椒堿樣品(自制)；乙腈(色譜純，Sigma 有限公司)；甲醇(色譜純，Sigma有限公司)；磷酸(西安化學試劑廠，分析純，20090420)；水(超低有機物超純水機制得)。

2方法與結果

2.1溶液的配制辣椒辣素對照品溶液：分別精密稱取辣椒辣素對照品10.08 mg，加甲醇溶解并稀釋至10 mL，作為對照品儲備液(1.080 0 mg·mL-1)。

二氫辣椒辣素對照品溶液：精密稱取二氫辣椒辣素對照品12.09 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，作為對照品儲備液(0.483 6 mg·mL-1)。

混合對照品溶液:精密量取辣椒辣素對照品儲備液1.00 mL和二氫辣椒辣素對照品溶液0.50 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得待測成分混合對照品溶液(C辣椒辣素=0.108 0 mg·mL-1；C二氫辣椒辣素=0.024 2 mg·mL-1)。

供試品溶液:分別精密稱取樣品26.2，26.1，26.0，25.4，25.0和25.4 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，精密量取1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，得6份供試品溶液。

2.2方法學考察

2.2.1色譜條件色譜柱：苯基鍵合硅膠填充柱(Waters，XTerra Phenyl，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(40∶60)；柱溫：30 ℃；檢測波長：281 nm；進樣量：20 μL[15]；分析時間：40 min。

2.2.2專屬性及系統(tǒng)適用性實驗分別取混合對照品溶液、供試品溶液各20 μL進樣，色譜圖見圖1。

在采用的色譜條件下，混合對照品和供試品色譜圖中辣椒辣素、二氫辣椒辣素和其他辣椒辣素類達到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000。

圖1HPLC圖a.對照品；b.供試品；1.辣椒辣素；2.二氫辣椒辣素；3.其他辣椒堿

Fig.1 The HPLC chromatograms

a.the mixed references；b.the test；1.capsaicin；2.dihydrocapsaicin；3.other capsaicin

2.2.3線性與范圍及校正因子計算

2.2.3.1線性與范圍分別精密吸取辣椒辣素對照品溶液和二氫辣椒辣素對照品溶液各0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20和1.40 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準系列質量濃度溶液，進樣20 μL，記錄峰面積。

分別以辣椒辣素對照品、二氫辣椒辣素對照品的質量濃度對峰面積進行線性回歸，得回歸方程依次為：Y=11 552X+21.24，r=0.999 9；Y=10 270X+9.285，r=0.999 9。表明辣椒辣素在0.020 2～0.141 7 mg·mL-1范圍內(nèi)、二氫辣椒辣素在0.009 7～0.067 7 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關系良好。

2.2.3.2校正因子計算以辣椒辣素為內(nèi)標，按下式計算二氫辣椒辣素的校正因子，見表1。

式中As為內(nèi)參物對照品峰面積，Cs為內(nèi)參物對照品質量濃度；Ai為某待測成分對照品峰面積，Ci為某待測成分對照品質量濃度。結果顯示，二氫辣椒辣素的平均校正因子為1.12，RSD為1.32%，符合要求[12]。

2.2.4穩(wěn)定性實驗取同一混合供試品溶液，分別于第0，4，8，12和24 h進樣檢測，記錄峰面積并計算含量的RSD值，結果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量的RSD分別為0.72%和1.29%，均小于5%，辣椒辣素和二氫辣椒辣素溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5精密度分別吸取質量濃度為0.040 5，0.081 0和0.121 4 mg·mL-1的混合對照品溶液適量，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算RSD值。結果顯示，3種質量濃度辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積的RSD依次為1.81%和1.89%，0.24%和1.57%，1.92%和0.30%，均小于5%，精密度符合要求[12]。

表1二氫辣椒辣素的校正因子

Tab.1 The correction factor of dihydrocapsaicin

編號AsCs/mg·mL-1AiCi/mg·mL-1fSi1260.90.0202110.10.00971.132484.00.0405211.30.01931.093716.60.0607301.50.02901.144959.90.0810404.40.03871.1351188.50.1012508.30.04841.1261431.20.1214604.90.05801.1371654.40.1417705.90.06771.12

注：Cs、Ci分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素的質量濃度；As、Ai分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積。

2.2.6重復性實驗取供試品6份，按供試品處理方法制備樣品，測定辣辣素和二氫辣椒辣素含量，并計算其RSD值。結果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量的RSD分別為1.08%和1.78%，均小于5%，重復性符合要求[12]。

2.2.7加樣回收率在已知含量的樣品中分別加入相當于待測物含量的80%，100%和120%的對照品，加樣回收率和RSD值見表2。結果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素的加樣回收率RSD均小于5%，加樣回收率符合要求[12]。

表2加樣回收率實驗

Tab.2 The results of recovery test

編號辣椒辣素本底值/mg加入量/mg實測值/mg回收率/%二氫辣椒辣素本底值/mg加入量/mg實測值/mg回收率/%低0.03790.03460.0740104.50.008790.007740.0168103.60.13790.03460.0740104.30.008790.007740.0167102.30.03790.03460.0734102.50.008790.007740.0168103.3中0.03790.04320.080498.30.008790.009670.018499.50.03790.04320.079696.50.008790.009670.0188103.70.03790.04320.080899.20.008790.009670.0188103.8高0.03790.05180.0919104.10.008790.01160.020298.10.03790.05180.089198.80.008790.01160.0206101.80.03790.05180.088898.10.008790.01160.0208103.1RSD/%3.091.98

2.3一測多評方法的耐用性評價按一測多評法技術要求，按照2.2.1項下色譜條件，微調流動相比例、柱溫、流速和檢測波長，測定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量，計算二氫辣椒辣素的校正因子，考察方法的耐用性，結果見表3。結果顯示，流動相比例、柱溫、流速和檢測波長發(fā)生較小變化時，計算得二氫辣椒辣素校正因子RSD均小于5%，所建方法耐用性符合要求[12]。

表3耐用性實驗結果

Tab 3 The results of durability test

考察項目Cs/mg·mL-1AsCi/mg·mL-1AifSiRSD/%A∶B35∶650.1081162.20.0242240.41.164.3640∶600.1081172.00.0242226.61.1645∶550.1081241.20.0242258.41.08柱溫/℃250.1081226.90.0242256.41.074.59300.1081172.00.0242226.61.16350.1081235.60.0242258.61.07流速/mL·min-10.80.1081339.20.0242267.71.123.791.00.1081172.00.0242226.61.161.20.1081117.80.0242241.11.07檢測波長/nm2790.1081111.40.0242226.11.102.732810.1081172.00.0242226.61.162830.1081101.80.0242222.11.11

注：Cs、Ci分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素的濃度；As、Ai分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積。

2.4待測組分色譜峰的定位(專屬性)專屬性用各組分保留時間及相對保留時間差表示。以辣椒辣素的保留時間為1.00，計算二氫辣椒辣素的相對保留值及二者的保留時間差。見表4。

相對保留值r二氫辣椒辣素/辣椒辣素=

tR二氫辣椒辣素/tR辣椒辣素

保留時間差ΔtR=t二氫辣椒辣素-tR辣椒辣素

結果表明,二氫辣椒辣素的相對保留時間及二者的保留時間差的RSD均小于5%，符合要求[12]。

表4各組分的相對保留時間及保留時間差

Tab.4 The relative retention time and the retention time difference of each component

編號tR辣椒辣素tR二氫辣椒辣素r二氫辣椒素/辣椒辣素ΔtR113.29418.0101.3554.716213.30218.0201.3554.718313.31418.0361.3554.722413.30718.0261.3554.719513.30718.0261.3554.719613.29518.0081.3544.713RSD/%0.030.06

2.5樣品測定分別精密吸取混合對照品溶液、辣椒辣素對照品溶液、供試品溶液各20 μL，進樣。采用外標一點法測得辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量分別為0.733 8和0.171 2 g·g-1，一測多評法計算供試品中二氫辣椒辣素的含量為0.171 3 g·g-1。采用SPSS 17.0軟件，對二氫辣椒辣素的外標法測定值和一測多評法計算值作t檢驗分析，結果P>0.05，說明采用一測多評法計算的二氫辣椒辣素的含量與實測含量沒有顯著性差異。

3討論

本實驗利用一測多評法對天然辣椒素中辣椒辣素和二氫辣椒辣素進行含量測定。以辣椒辣素為內(nèi)參物，計算二氫辣椒辣素的相對校正因子，并利用相對校正因子計算其含量。對二氫辣椒辣素的測定值和計算值作t檢驗分析，結果表明，一測多評法計算的二氫辣椒辣素的含量與實測含量沒有顯著性差異，說明建立的相對校正因子具有較高的可信度。

一測多評法可簡化操作，其最大優(yōu)勢在于節(jié)省對照品，可作為新的質量評價模式用于辣椒辣素類物質的質量評價。

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Determination of two main ingredients in natural capsaicin extract by quantitative analysis of multi-components with a single-marker

LI Jinfang1，SONG Bailing1,3，ZHANG Wei1，LI Xinxia1,2*

(1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China； 2.Central Laboratory， Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3. Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Limited Company，Urumqi 830011，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for determination of two components in natural capsaicin by one reference substance. MethodsQuantitative analysis of multi-components was performed to determine the contents of dihydrocapsaicin and capsaicin with capsaicin as the reference substance by single-maker(QAMS) and HPLC. ResultsThe relative correction factor between capsaicin and dihydrocapsaicin was 1.12. There was no significant difference of the measured values between the external standard method and QAMS (P>0.05). With capsaicin retention time of 1.00， the relative retention time of dihydrocapsaicin was 1.355 and the RSD was less than 5%.ConclusionWith capsaicin as a single marker and the relative correction factor of dihydrocapsaicin，QAMS could be applied for the determination of the main components of natural capsaicin extract simultaneously.Key words: capsaicin；dihydrocapsaicin；quantitative analysis of multi-components by single-maker(QAMS)； HPLC；correction factor

(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類號：R927.2

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)03-0251-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.009

*通信作者：李新霞，女，教授，博士生導師

作者簡介：李金芳，女，在讀碩士研究生

基金項目：國家自然科學基金項目(編號：81260486)