李金芳，宋百靈，3，張　唯，李新霞，2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊　830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊　830011；3.新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊　830011)

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一測(cè)多評(píng)法測(cè)定天然辣椒堿中2種主要成分

李金芳1，宋百靈1，3，張唯1，李新霞1，2*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830011；3.新疆埃樂(lè)欣藥業(yè)有限公司，烏魯木齊830011)

摘要：目的建立以1種對(duì)照品同時(shí)測(cè)定天然辣椒堿中2種成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。方法以辣椒辣素為對(duì)照，采用一測(cè)多評(píng)法，同時(shí)測(cè)定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量。結(jié)果測(cè)得辣椒辣素與二氫辣椒辣素的相對(duì)校正因子為1.12，同時(shí)采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)定樣品中二氫辣椒辣素含量，采用t檢驗(yàn)對(duì)二者測(cè)定值進(jìn)行比較，二者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)；以辣椒辣素的保留時(shí)間為1.00，計(jì)算得二氫辣椒辣素的相對(duì)保留時(shí)間為1.355，相對(duì)保留時(shí)間及保留時(shí)間差的RSD均小于5%。結(jié)論采用一測(cè)多評(píng)法，以辣椒辣素為對(duì)照，利用相對(duì)校正因子可實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量。

關(guān)鍵詞：辣椒辣素；二氫辣椒辣素；一測(cè)多評(píng)；HPLC；校正因子

辣椒堿類(lèi)化合物(capsaicinoids)是辣椒的標(biāo)志性成分，包括辣椒辣素、二氫辣椒辣素、降二氫辣椒辣素、高二氫辣椒辣素和高辣椒辣素等[1]。其中辣椒辣素和二氫辣椒辣素約占辣椒堿總量的90%[2]，二者含量因品種、產(chǎn)地、栽培環(huán)境的不同而存在差異，因此，辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量是辣椒品質(zhì)評(píng)定的重要指標(biāo)。

辣椒辣素(capsaicin)化學(xué)名為8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺，是一種含酚羥基的生物堿[3]，二氫辣椒辣素(dihydrocapsaicin，DHC)是辣椒辣素的氫化產(chǎn)物，二者含量高低影響其辣度。辣椒堿類(lèi)化合物的主要藥效有鎮(zhèn)痛[4]、止咳[5]、抗疲勞、抗炎、殺菌、抗病毒[6-7]及對(duì)心血管和消化系統(tǒng)的保護(hù)作用等。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)高純度的辣椒堿可以殺死癌細(xì)胞，減少細(xì)胞癌變[8-9]；高純辣椒堿可以制成戒毒藥物[10]。

天然藥物有效成分多為類(lèi)群，類(lèi)群成分間存在某些內(nèi)在關(guān)聯(lián)，2006年，王智民等首次提出并建立了適合于中藥特點(diǎn)的一測(cè)多評(píng)測(cè)定法(quantitative analysis of multi-components by single-maker，QAMS)。一測(cè)多評(píng)法[11]：在一定的線性范圍內(nèi)成分的量(質(zhì)量或濃度)與響應(yīng)值成正比，使用多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以樣品中某一典型組分(易得、廉價(jià)、有效)為對(duì)照，建立其與其他組分(對(duì)照品難獲得、不穩(wěn)定或價(jià)格昂貴)的相對(duì)校正因子，依據(jù)相對(duì)校正因子推算樣品中其他組分含量，并使其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值符合定量方法學(xué)要求的一種方法。一測(cè)多評(píng)法已被2010年版《中國(guó)藥典》收錄，在多種中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)研究中得到應(yīng)用[12-14]。

美國(guó)藥典收載了辣椒堿提取物、辣椒、辣椒油3個(gè)品種，分別以辣椒辣素、二氫辣椒辣素為對(duì)照品，采用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定[15]。歐盟藥典收載了辣椒、辣椒油、辣椒流浸膏、辣椒酊劑4個(gè)品種，均以辣椒辣素為對(duì)照品，采用HPLC法，測(cè)定總辣椒堿含量[16]。《中國(guó)藥典》收載了辣椒品種，分別以辣椒辣素、二氫辣椒辣素為對(duì)照品，采用HPLC法測(cè)定總辣椒堿含量[17]。

本實(shí)驗(yàn)擬以辣椒辣素為對(duì)照品參考美國(guó)藥典中辣椒堿的含量測(cè)定方法，采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定兩者之間的相對(duì)校正因子，推算二氫辣椒辣素的含量，用于辣椒堿類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

1儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀(1260，安捷倫科技有限公司)；分析天平(AB135-S，d=0.01/0.1 mg，Mettler-Teledo集團(tuán))；超低有機(jī)物超純水機(jī)(Milli-Q Reference，密理博中國(guó)有限公司)。

1.2試藥辣椒堿(capsaicin，北京百靈威科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99%，批號(hào)LF400122)；二氫辣椒堿(dihydro capsaicin，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96%，批號(hào)1-LIV-100-1)；天然辣椒堿樣品(自制)；乙腈(色譜純，Sigma 有限公司)；甲醇(色譜純，Sigma有限公司)；磷酸(西安化學(xué)試劑廠，分析純，20090420)；水(超低有機(jī)物超純水機(jī)制得)。

2方法與結(jié)果

2.1溶液的配制辣椒辣素對(duì)照品溶液：分別精密稱(chēng)取辣椒辣素對(duì)照品10.08 mg，加甲醇溶解并稀釋至10 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.080 0 mg·mL-1)。

二氫辣椒辣素對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取二氫辣椒辣素對(duì)照品12.09 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.483 6 mg·mL-1)。

混合對(duì)照品溶液:精密量取辣椒辣素對(duì)照品儲(chǔ)備液1.00 mL和二氫辣椒辣素對(duì)照品溶液0.50 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻即得待測(cè)成分混合對(duì)照品溶液(C辣椒辣素=0.108 0 mg·mL-1；C二氫辣椒辣素=0.024 2 mg·mL-1)。

供試品溶液:分別精密稱(chēng)取樣品26.2，26.1，26.0，25.4，25.0和25.4 mg，加甲醇溶解并稀釋至25 mL，精密量取1 mL，加甲醇稀釋至10 mL，得6份供試品溶液。

2.2方法學(xué)考察

2.2.1色譜條件色譜柱：苯基鍵合硅膠填充柱(Waters，XTerra Phenyl，250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-1 mL·L-1磷酸(40∶60)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：281 nm；進(jìn)樣量：20 μL[15]；分析時(shí)間：40 min。

2.2.2專(zhuān)屬性及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)分別取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL進(jìn)樣，色譜圖見(jiàn)圖1。

在采用的色譜條件下，混合對(duì)照品和供試品色譜圖中辣椒辣素、二氫辣椒辣素和其他辣椒辣素類(lèi)達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于5 000。

圖1HPLC圖a.對(duì)照品；b.供試品；1.辣椒辣素；2.二氫辣椒辣素；3.其他辣椒堿

Fig.1 The HPLC chromatograms

a.the mixed references；b.the test；1.capsaicin；2.dihydrocapsaicin；3.other capsaicin

2.2.3線性與范圍及校正因子計(jì)算

2.2.3.1線性與范圍分別精密吸取辣椒辣素對(duì)照品溶液和二氫辣椒辣素對(duì)照品溶液各0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20和1.40 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)系列質(zhì)量濃度溶液，進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。

分別以辣椒辣素對(duì)照品、二氫辣椒辣素對(duì)照品的質(zhì)量濃度對(duì)峰面積進(jìn)行線性回歸，得回歸方程依次為：Y=11 552X+21.24，r=0.999 9；Y=10 270X+9.285，r=0.999 9。表明辣椒辣素在0.020 2～0.141 7 mg·mL-1范圍內(nèi)、二氫辣椒辣素在0.009 7～0.067 7 mg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.2.3.2校正因子計(jì)算以辣椒辣素為內(nèi)標(biāo)，按下式計(jì)算二氫辣椒辣素的校正因子，見(jiàn)表1。

式中As為內(nèi)參物對(duì)照品峰面積，Cs為內(nèi)參物對(duì)照品質(zhì)量濃度；Ai為某待測(cè)成分對(duì)照品峰面積，Ci為某待測(cè)成分對(duì)照品質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，二氫辣椒辣素的平均校正因子為1.12，RSD為1.32%，符合要求[12]。

2.2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一混合供試品溶液，分別于第0，4，8，12和24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積并計(jì)算含量的RSD值，結(jié)果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量的RSD分別為0.72%和1.29%，均小于5%，辣椒辣素和二氫辣椒辣素溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5精密度分別吸取質(zhì)量濃度為0.040 5，0.081 0和0.121 4 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積并計(jì)算RSD值。結(jié)果顯示，3種質(zhì)量濃度辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積的RSD依次為1.81%和1.89%，0.24%和1.57%，1.92%和0.30%，均小于5%，精密度符合要求[12]。

表1二氫辣椒辣素的校正因子

Tab.1 The correction factor of dihydrocapsaicin

編號(hào)AsCs/mg·mL-1AiCi/mg·mL-1fSi1260.90.0202110.10.00971.132484.00.0405211.30.01931.093716.60.0607301.50.02901.144959.90.0810404.40.03871.1351188.50.1012508.30.04841.1261431.20.1214604.90.05801.1371654.40.1417705.90.06771.12

注：Cs、Ci分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素的質(zhì)量濃度；As、Ai分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積。

2.2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取供試品6份，按供試品處理方法制備樣品，測(cè)定辣辣素和二氫辣椒辣素含量，并計(jì)算其RSD值。結(jié)果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量的RSD分別為1.08%和1.78%，均小于5%，重復(fù)性符合要求[12]。

2.2.7加樣回收率在已知含量的樣品中分別加入相當(dāng)于待測(cè)物含量的80%，100%和120%的對(duì)照品，加樣回收率和RSD值見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，辣椒辣素和二氫辣椒辣素的加樣回收率RSD均小于5%，加樣回收率符合要求[12]。

表2加樣回收率實(shí)驗(yàn)

Tab.2 The results of recovery test

編號(hào)辣椒辣素本底值/mg加入量/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%二氫辣椒辣素本底值/mg加入量/mg實(shí)測(cè)值/mg回收率/%低0.03790.03460.0740104.50.008790.007740.0168103.60.13790.03460.0740104.30.008790.007740.0167102.30.03790.03460.0734102.50.008790.007740.0168103.3中0.03790.04320.080498.30.008790.009670.018499.50.03790.04320.079696.50.008790.009670.0188103.70.03790.04320.080899.20.008790.009670.0188103.8高0.03790.05180.0919104.10.008790.01160.020298.10.03790.05180.089198.80.008790.01160.0206101.80.03790.05180.088898.10.008790.01160.0208103.1RSD/%3.091.98

2.3一測(cè)多評(píng)方法的耐用性評(píng)價(jià)按一測(cè)多評(píng)法技術(shù)要求，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件，微調(diào)流動(dòng)相比例、柱溫、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定辣椒辣素和二氫辣椒辣素的含量，計(jì)算二氫辣椒辣素的校正因子，考察方法的耐用性，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，流動(dòng)相比例、柱溫、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)發(fā)生較小變化時(shí)，計(jì)算得二氫辣椒辣素校正因子RSD均小于5%，所建方法耐用性符合要求[12]。

表3耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab 3 The results of durability test

考察項(xiàng)目Cs/mg·mL-1AsCi/mg·mL-1AifSiRSD/%A∶B35∶650.1081162.20.0242240.41.164.3640∶600.1081172.00.0242226.61.1645∶550.1081241.20.0242258.41.08柱溫/℃250.1081226.90.0242256.41.074.59300.1081172.00.0242226.61.16350.1081235.60.0242258.61.07流速/mL·min-10.80.1081339.20.0242267.71.123.791.00.1081172.00.0242226.61.161.20.1081117.80.0242241.11.07檢測(cè)波長(zhǎng)/nm2790.1081111.40.0242226.11.102.732810.1081172.00.0242226.61.162830.1081101.80.0242222.11.11

注：Cs、Ci分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素的濃度；As、Ai分別為辣椒辣素和二氫辣椒辣素峰面積。

2.4待測(cè)組分色譜峰的定位(專(zhuān)屬性)專(zhuān)屬性用各組分保留時(shí)間及相對(duì)保留時(shí)間差表示。以辣椒辣素的保留時(shí)間為1.00，計(jì)算二氫辣椒辣素的相對(duì)保留值及二者的保留時(shí)間差。見(jiàn)表4。

相對(duì)保留值r二氫辣椒辣素/辣椒辣素=

tR二氫辣椒辣素/tR辣椒辣素

保留時(shí)間差ΔtR=t二氫辣椒辣素-tR辣椒辣素

結(jié)果表明,二氫辣椒辣素的相對(duì)保留時(shí)間及二者的保留時(shí)間差的RSD均小于5%，符合要求[12]。

表4各組分的相對(duì)保留時(shí)間及保留時(shí)間差

Tab.4 The relative retention time and the retention time difference of each component

編號(hào)tR辣椒辣素tR二氫辣椒辣素r二氫辣椒素/辣椒辣素ΔtR113.29418.0101.3554.716213.30218.0201.3554.718313.31418.0361.3554.722413.30718.0261.3554.719513.30718.0261.3554.719613.29518.0081.3544.713RSD/%0.030.06

2.5樣品測(cè)定分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、辣椒辣素對(duì)照品溶液、供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣。采用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)得辣椒辣素和二氫辣椒辣素含量分別為0.733 8和0.171 2 g·g-1，一測(cè)多評(píng)法計(jì)算供試品中二氫辣椒辣素的含量為0.171 3 g·g-1。采用SPSS 17.0軟件，對(duì)二氫辣椒辣素的外標(biāo)法測(cè)定值和一測(cè)多評(píng)法計(jì)算值作t檢驗(yàn)分析，結(jié)果P>0.05，說(shuō)明采用一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的二氫辣椒辣素的含量與實(shí)測(cè)含量沒(méi)有顯著性差異。

3討論

本實(shí)驗(yàn)利用一測(cè)多評(píng)法對(duì)天然辣椒素中辣椒辣素和二氫辣椒辣素進(jìn)行含量測(cè)定。以辣椒辣素為內(nèi)參物，計(jì)算二氫辣椒辣素的相對(duì)校正因子，并利用相對(duì)校正因子計(jì)算其含量。對(duì)二氫辣椒辣素的測(cè)定值和計(jì)算值作t檢驗(yàn)分析，結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法計(jì)算的二氫辣椒辣素的含量與實(shí)測(cè)含量沒(méi)有顯著性差異，說(shuō)明建立的相對(duì)校正因子具有較高的可信度。

一測(cè)多評(píng)法可簡(jiǎn)化操作，其最大優(yōu)勢(shì)在于節(jié)省對(duì)照品，可作為新的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式用于辣椒辣素類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

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Determination of two main ingredients in natural capsaicin extract by quantitative analysis of multi-components with a single-marker

LI Jinfang1，SONG Bailing1,3，ZHANG Wei1，LI Xinxia1,2*

(1.College of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China； 2.Central Laboratory， Xinjiang Medical University，Urumqi 830011，China；3. Xinjiang Ailexin Pharmaceutical Limited Company，Urumqi 830011，China)

Abstract:ObjectiveTo establish a method for determination of two components in natural capsaicin by one reference substance. MethodsQuantitative analysis of multi-components was performed to determine the contents of dihydrocapsaicin and capsaicin with capsaicin as the reference substance by single-maker(QAMS) and HPLC. ResultsThe relative correction factor between capsaicin and dihydrocapsaicin was 1.12. There was no significant difference of the measured values between the external standard method and QAMS (P>0.05). With capsaicin retention time of 1.00， the relative retention time of dihydrocapsaicin was 1.355 and the RSD was less than 5%.ConclusionWith capsaicin as a single marker and the relative correction factor of dihydrocapsaicin，QAMS could be applied for the determination of the main components of natural capsaicin extract simultaneously.Key words: capsaicin；dihydrocapsaicin；quantitative analysis of multi-components by single-maker(QAMS)； HPLC；correction factor

(收稿日期：2015-06-23)

中圖分類(lèi)號(hào)：R927.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0251-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.009

*通信作者：李新霞，女，教授，博士生導(dǎo)師

作者簡(jiǎn)介：李金芳，女，在讀碩士研究生

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81260486)