楊明冠，朱傳合

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安　271018）

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超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機(jī)理研究

楊明冠，*朱傳合

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安271018）

摘要：以鮮切馬鈴薯為試材，通過研究不同超聲處理?xiàng)l件對(duì)酶促褐變底物、產(chǎn)物以及多酚氧化酶的影響，揭示了超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機(jī)理。結(jié)果表明，超聲處理對(duì)酶促褐變底物、產(chǎn)物并沒有影響，且能夠顯著抑制多酚氧化酶的酶活力。以超聲功率600 W超聲處理90 min，馬鈴薯多酚氧化酶的酶活力僅為原酶液的54.21%，可見超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變是通過抑制相關(guān)酶的活力來實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：鮮切馬鈴薯；酶促褐變；超聲處理；多酚氧化酶

0　引言

鮮切馬鈴薯是指新鮮馬鈴薯經(jīng)清洗、修整、去皮、切割并包裝成供消費(fèi)者立即使用的產(chǎn)品[1]。鮮切馬鈴薯作為一種新型的馬鈴薯初加工制品備受消費(fèi)者青睞，在眾多的微加工果蔬中馬鈴薯的消費(fèi)量逐漸增大。然而，鮮切果蔬由于切割傷害使得原本區(qū)域化分布的酚類物質(zhì)和酚酶接觸，從而酚類物質(zhì)被氧化生成鄰苯二醌，繼而轉(zhuǎn)化為褐色素，導(dǎo)致褐變[2]。酶促褐變是鮮切果蔬最主要的品質(zhì)問題，導(dǎo)致鮮切產(chǎn)品感官品質(zhì)下降、營(yíng)養(yǎng)損失及貨架期縮短，大大限制了鮮切果蔬業(yè)的發(fā)展。酶促褐變反應(yīng)的發(fā)生，需要同時(shí)具備酚類底物、酚酶和氧氣3個(gè)條件。因此，可以通過減少酚類物質(zhì)含量、抑制酶促褐變相關(guān)酶的活性以及降低氧氣濃度來控制鮮切馬鈴薯的酶促褐變。例如，抗壞血酸可以通過減少褐變底物抑制酶促褐變[3-4]；熱處理、亞硫酸鹽、靜高壓以及高密度二氧化碳可以通過抑制酶活性來抑制酶促褐變[5-8]；涂膜則可以通過隔絕氧氣抑制酶促褐變[9]。

超聲處理作為一種非熱加工手段已經(jīng)在食品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。超聲波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，利用其振動(dòng)能量，可以在介質(zhì)中產(chǎn)生強(qiáng)大的剪切力和高溫，來改變物質(zhì)的組織結(jié)構(gòu)、狀態(tài)及功能[10]。前期研究已經(jīng)報(bào)道證實(shí)了超聲處理可以抑制鮮切馬鈴薯的酶促褐變[11]，但是對(duì)超聲處理抑制鮮切果蔬酶促褐變的機(jī)理目前尚不清楚。

本試驗(yàn)以鮮切馬鈴薯為試驗(yàn)材料，旨在探究超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機(jī)理，為了更加系統(tǒng)地闡明超聲抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機(jī)理，采用模擬體系探究了超聲處理對(duì)鮮切馬鈴薯酶促褐變底物、產(chǎn)物以及酶促褐變相關(guān)酶的影響，從而揭示超聲處理抑制鮮切馬鈴薯酶促褐變的機(jī)理，為控制鮮切果蔬酶促褐變提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

馬鈴薯（荷蘭15號(hào)），購(gòu)于泰安市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，貯藏于4℃的冷庫(kù)中備用。馬鈴薯PPO酶粉，購(gòu)于Sigma公司，L -多巴、L -酪氨酸，均為分析純。

JA2002型電子天平，上海精天電子儀器有限公司產(chǎn)品；KQ- 600DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TGL- 18C- C型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，上海安亭公司產(chǎn)品；DZKW- C型數(shù)顯恒溫水浴鍋，黃驊市卸甲綜合電器廠產(chǎn)品；UV-2102PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯有限公司產(chǎn)品；Vertex- 70型紅外光譜儀，德國(guó)BRUKER公司產(chǎn)品。

1.2分析方法

1.2.1褐變底物結(jié)構(gòu)分析方法

（1）紫外吸收光譜分析法。波長(zhǎng)范圍為200～800 nm，光譜帶寬為2 nm。

（2）紅外光譜分析法。采用KBr壓片法，波數(shù)掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率2 cm-1。

（3）液質(zhì)聯(lián)用分析法。①色譜分析條件：色譜柱為C18柱（3.5 μm，250 mm×4.6 mm），柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min，流動(dòng)相為甲醇-水-冰醋酸。②質(zhì)譜分析條件：電噴霧離子化源，正離子模式，掃描范圍10～200 m/z，毛細(xì)管電壓1.5 kV，霧化氣壓力30 psi，干燥氣溫度300℃。

1.2.2褐變產(chǎn)物量分析方法

由于酶促褐變產(chǎn)物于波長(zhǎng)475 nm處有最大吸收峰[12]，故采用△A475表示褐變產(chǎn)物的量。

1.2.3PPO酶活測(cè)定方法

采用紫外分光光度法測(cè)定PPO酶活。反應(yīng)體系中依次加入1.8 mL pH值6.6的磷酸緩沖液，1.0 mL 0.5 mmo1/L的L -多巴溶液以及0.2 mL PPO酶液，所加試劑均在30℃溫育15 min，于波長(zhǎng)475 nm處進(jìn)行比色。加酶液后立刻開始計(jì)時(shí)，每30 s記錄A475值，連續(xù)記錄3 min，對(duì)照不加酶液，重復(fù)測(cè)定3次。酶活以1 mL酶液1 min OD值每增加0.001為1個(gè)活力單位。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1超聲處理對(duì)酶促褐變底物的影響

超聲處理L -酪氨酸、L -多巴溶液30 min，以不做處理為對(duì)照，采用紫外吸收光譜、紅外光譜、質(zhì)譜對(duì)其分析。

模擬酶促褐變體系，在酶的最適反應(yīng)條件下以超聲功率600 W超聲處理30 min的L -多巴溶液為反應(yīng)底物，以不做超聲處理的底物溶液為對(duì)照，分別加入反應(yīng)體系測(cè)定酶促褐變反應(yīng)，以△A475表示褐變產(chǎn)物的量。

1.3.2超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物的影響

模擬酶促褐變體系，使底物完全反應(yīng)后加熱滅酶，超聲處理并作對(duì)照，以體系中最終酶促褐變產(chǎn)物的量來判斷超聲處理是否對(duì)酶促褐變產(chǎn)物有影響。設(shè)置2個(gè)試驗(yàn)組，在最適反應(yīng)條件下加入反應(yīng)液，加酶液后立刻計(jì)時(shí)，每1 min記錄A475值，15 min后加熱滅酶，處理組超聲功率600 W超聲處理30 min，對(duì)照組在相同溫度下水浴30 min，記錄A475值至20 min，以△A475表示褐變產(chǎn)物的量。

1.3.3超聲處理對(duì)酶促褐變反應(yīng)體系的影響

設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組，在最適反應(yīng)條件下加入反應(yīng)液，加酶液后立刻計(jì)時(shí)并記錄A475值。對(duì)照組1反應(yīng)15 min，對(duì)照組2和處理組反應(yīng)3 min后加熱滅酶，處理組超聲功率600 W超聲處理30 min，對(duì)照組2在相同溫度下水浴30 min，然后加入等量的酶液記錄A475值至15 min，以△A475表示褐變產(chǎn)物的量。

1.3.4超聲處理對(duì)鮮切馬鈴薯PPO酶活力的影響

固定超聲頻率為40 kHz，以鮮切馬鈴薯PPO酶為研究對(duì)象，分別研究超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度、pH值對(duì)PPO酶活力的影響。

1.3.5數(shù)據(jù)分析

各項(xiàng)試驗(yàn)均重復(fù)3次，采用DPS 7.05軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平p＜0.05。

2　結(jié)果與分析

2.1超聲處理對(duì)酶促褐變底物的影響

2.1.1超聲處理對(duì)底物紫外吸收光譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，不同功率超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對(duì)照，分別測(cè)定其紫外吸收光譜。

超聲處理對(duì)酶促褐變底物紫外吸收光譜的影響見圖1。

圖1中（a）、（b）分別是超聲處理對(duì)L -酪氨酸、L -多巴紫外吸收光譜的影響。由圖1（a）可知，L -酪氨酸于270～280 nm處有一個(gè)明顯的吸收波峰，275 nm處有最大吸收值。由圖1（b）可知，L -多巴于275～285 nm處有一個(gè)明顯的吸收波峰，280 nm處有最大吸收值。超聲處理并沒有改變L -酪氨酸和L -多巴的紫外吸收光譜，處理后的紫外吸收光譜與未經(jīng)超聲處理基本一致。根據(jù)圖1顯示，超聲處理對(duì)底物紫外吸收光譜基本沒有影響，故后續(xù)試驗(yàn)處理選用超聲功率為600 W。

2.1.2超聲處理對(duì)底物紅外光譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W的超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對(duì)照，分別測(cè)定其紅外光譜。

圖1　超聲處理對(duì)酶促褐變底物紫外吸收光譜的影響

超聲處理對(duì)酶促褐變底物紅外光譜的影響見圖2。

圖2　超聲處理對(duì)酶促褐變底物紅外光譜的影響

由圖2（a）可知，超聲處理對(duì)L -酪氨酸酚羥基吸收峰（3 205 cm-1）、氨基吸收峰（3 135 cm-1）、苯環(huán)上C- H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 588 cm-1）、苯環(huán)對(duì)二取代C- H彎曲振動(dòng)吸收峰（798 cm-1）、苯環(huán)C- H彎曲振動(dòng)吸收峰（649 cm-1）沒有影響。圖2（b）可知，超聲處理對(duì)L -多巴酚羥基吸收峰（3 401 cm-1）、氨基吸收峰（3 210 cm-1）、苯環(huán)上C- H鍵伸縮振動(dòng)吸收峰（3 000～3 100 cm-1）、羰基吸收峰（1 655 cm-1）、苯環(huán)1,2,4 -三取代C- H彎曲振動(dòng)吸收峰（816 cm-1）、苯環(huán)C- H彎曲振動(dòng)吸收峰（676 cm-1）也沒有影響?？梢?，超聲處理對(duì)L -酪氨酸、L -多巴的峰形和出峰位置均沒有影響，只是在吸收強(qiáng)度上略有差異。

2.1.3超聲處理對(duì)底物質(zhì)譜的影響

30℃條件下，采用超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W的超聲處理L -多巴、L -酪氨酸溶液30 min，以不做超聲處理為對(duì)照，分別測(cè)定其質(zhì)譜。

超聲處理對(duì)酶促褐變質(zhì)譜的影響見圖3。

圖3　超聲處理對(duì)酶促褐變質(zhì)譜的影響

圖3中（a）、（b）分別是超聲處理對(duì)L -酪氨酸、L -多巴質(zhì)譜的影響。由圖3（a）可知，L -酪氨酸處理組與對(duì)照組的質(zhì)譜圖基本重合，181 m/z分子離子峰以及主要的峰都沒有差異。圖3（b）中顯示，經(jīng)過超聲處理的L -多巴溶液質(zhì)譜圖與對(duì)照組也基本重合，197 m/z分子離子峰以及主要的峰都沒有差異。

2.1.4超聲處理底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)的影響

30℃條件下，將超聲處理底物（600 W，30 min）及未經(jīng)超聲處理底物加入酶促褐變反應(yīng)體系，以A475值為指標(biāo)表示褐變反應(yīng)的程度，研究超聲處理底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)的影響。

超聲處理底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)的影響見圖4。

由圖4可知，處理組與對(duì)照組15 min后基本反應(yīng)完全，反應(yīng)時(shí)間內(nèi)△A475沒有差異性（p＞0.05），可見超聲處理與未經(jīng)超聲處理的底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)沒有影響。結(jié)合處理前后底物的紫外吸收光譜、紅外光譜、質(zhì)譜推知，超聲處理底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)沒有影響。

2.2超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物的影響

圖4　超聲處理底物對(duì)酶促褐變反應(yīng)的影響

酶促褐變體系反應(yīng)15 min后加熱滅酶，作為酶促褐變產(chǎn)物。30℃條件下，超聲處理（600 W，30 min）產(chǎn)物，以未經(jīng)超聲處理產(chǎn)物為對(duì)照，以A475值為指標(biāo)，研究超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物的影響。

超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物的影響見圖5。

圖5　超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物的影響

由圖5可知，處理組與對(duì)照組15 min后基本反應(yīng)完全，反應(yīng)時(shí)間內(nèi)酶活曲線基本一致，△A475沒有差異性（p＞0.05），反應(yīng)15 min后加熱滅酶，A475值有輕微的上升并保持不變。試驗(yàn)過程中處理組與對(duì)照組△A475并沒有差異性，可見超聲處理對(duì)酶促褐變產(chǎn)物沒有影響。

2.3超聲處理對(duì)酶促褐變反應(yīng)體系的影響

酶促褐變體系反應(yīng)3 min后加熱滅酶，以此反應(yīng)液作為反應(yīng)中間體系。30℃條件下，將超聲處理的中間體系（600 W，30 min）及未經(jīng)超聲處理的中間體系加酶液繼續(xù)反應(yīng)，以A475值為指標(biāo)表示褐變反應(yīng)的程度，以不做任何處理的反應(yīng)體系為對(duì)照1，未經(jīng)超聲處理的中間體系為對(duì)照2，研究超聲處理對(duì)反應(yīng)體系的影響。

超聲處理對(duì)酶促褐變反應(yīng)體系的影響見圖6。

由圖6可知，對(duì)照組1反應(yīng)時(shí)間內(nèi)與酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線非常吻合，處理組和對(duì)照組2在3.5 min時(shí)出現(xiàn)了較大的增幅，這是由于體系中新加酶液使得酶促反應(yīng)又得以快速進(jìn)行，3.5 min后反應(yīng)比較符合酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線。由圖6可以看出，處理組和對(duì)照組2的反應(yīng)曲線相差不大，△A475并沒有差異性。推知，超聲處理對(duì)酶促褐變反應(yīng)體系沒有影響。

2.4超聲處理對(duì)PPO的影響

圖6　超聲處理對(duì)酶促褐變反應(yīng)體系的影響

2.4.1超聲功率對(duì)PPO的影響

30℃，pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz以不同超聲功率（240，300，360，420，480，540，600 W）超聲處理60 min，以不做超聲處理為對(duì)照，研究超聲功率對(duì)PPO酶活力的影響。

超聲功率對(duì)PPO酶活力的影響見圖7。

圖7　超聲功率對(duì)PPO酶活力的影響

由圖7可知，試驗(yàn)過程中對(duì)照組PPO酶活力很穩(wěn)定并基本維持不變，以對(duì)照組酶活力為100%探究超聲功率對(duì)鮮切馬鈴薯PPO酶活力的影響。由圖7可知，超聲處理可以顯著抑制PPO酶活力，并且隨著超聲功率的增大，酶活力迅速降低。在240 W處理?xiàng)l件下PPO酶活力為對(duì)照組酶液的93.01%，而以超聲功率600 W超聲處理后PPO酶活力僅為原酶液的66.43%。這與文獻(xiàn)報(bào)道的隨著超聲功率增加POD酶、ATP酶活力下降的結(jié)論一致[13]。酶活力的高低從根本上取決于酶分子構(gòu)象的合理程度，高強(qiáng)度超聲處理酶溶液時(shí)會(huì)產(chǎn)生瞬態(tài)空化作用，瞬間產(chǎn)生高溫、高壓、高能量密度沖擊波、微射流等極端物理作用，而酶分子在強(qiáng)大的剪切力和沖擊波的作用下，分子結(jié)構(gòu)被破壞，甚至被剪切成小碎片而表現(xiàn)出酶活力下降甚至失活[14]。

2.4.2超聲時(shí)間對(duì)PPO的影響

30℃，pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz、超聲功率600 W處理不同超聲時(shí)間（15，30，45，60，75，90 min），以不做超聲處理為對(duì)照，研究超聲時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響。

超聲時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響見圖8。

由圖8可知，試驗(yàn)過程中對(duì)照組的PPO酶活力基本維持不變，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，馬鈴薯PPO酶活力呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。600 W超聲處理15 min 后PPO酶活力下降幅度較小，酶活力為原酶液的89.70%；而經(jīng)過超聲處理90 min后PPO酶活力顯著下降，僅為原酶液的54.21%。在一定時(shí)間范圍內(nèi)超聲處理PPO，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)PPO酶活力降幅較大，此后繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間PPO酶活力的降幅變小，這說明超聲處理一定時(shí)間后，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響較小。這可能是由于高強(qiáng)度超聲場(chǎng)致效應(yīng)改變了PPO的分子構(gòu)象，從而導(dǎo)致了酶活力在短時(shí)間內(nèi)迅速降低；由于酶結(jié)構(gòu)具有柔性，繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，對(duì)PPO結(jié)構(gòu)也不會(huì)再有更進(jìn)一步的影響。

圖8　超聲時(shí)間對(duì)PPO酶活力的影響

2.4.3超聲溫度對(duì)PPO的影響

pH值6.6條件下，超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W在不同超聲溫度（20，25，30，35，40，45，50℃）條件下處理15 min，以不做超聲處理為對(duì)照，研究超聲溫度對(duì)PPO酶活力的影響。

超聲溫度對(duì)PPO酶活力的影響見圖9。

圖9　超聲溫度對(duì)PPO酶活力的影響

由圖9可知，馬鈴薯PPO最適宜溫度是30℃，超聲溫度過低會(huì)抑制PPO酶活力，而超聲溫度過高會(huì)破壞PPO的分子構(gòu)象，從而使酶失活。超聲溫度對(duì)超聲處理后PPO酶活力的影響趨勢(shì)和未經(jīng)超聲處理的趨勢(shì)相近，并沒有改變PPO的溫度條件，最適溫度仍為30℃。經(jīng)過超聲處理后PPO的酶活力都較對(duì)照組有所下降，在30℃條件下比較明顯，酶活力為原酶液的89.17%。

2.4.4超聲處理下不同pH值對(duì)PPO的影響

30℃條件下，超聲頻率40 kHz，超聲功率600 W在不同pH值（5.4，5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，7.8，8.2）條件下處理15 min，以不做超聲處理為對(duì)照，研究pH值對(duì)PPO酶活力的影響。

pH值對(duì)PPO酶活力的影響見圖10。

圖10　pH值對(duì)PPO酶活力的影響

由圖10可知，馬鈴薯PPO最適宜pH值范圍為6.2～7.0。經(jīng)過超聲處理后馬鈴薯PPO的最適pH值也是在這一個(gè)范圍內(nèi)，表明超聲處理并沒有改變PPO的穩(wěn)定pH值條件。試驗(yàn)中不同pH值條件下超聲處理后PPO的酶活力都較空白有所降低，pH值為6.2，6.6，7.0的條件下，酶活力分別為原酶液的84.37%，88.33%，86.04%。

3　結(jié)論

（1）超聲處理對(duì)酶促褐變底物、產(chǎn)物沒有影響。

（2）超聲處理并沒有改變PPO的最適溫度、pH值條件，卻可以顯著抑制PPO的酶活力。隨著超聲功率的增大、超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，PPO的酶活力逐漸降低。

（3）超聲處理抑制酶促褐變通過抑制相關(guān)酶的活力來實(shí)現(xiàn)。

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Study on Mechanism of Ultrasound Inhibiting Enzymatic Browning of Fresh- cut Potato

YANG Mingguan，*ZHU Chuanhe
（College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an，Shandong 271018，China）

Abstract：The effects of different ultrasonic treatment conditions on enzymatic browning substrates and products and polyphenol oxidase（PPO）activity of fresh- cut potato are investigated. The results indicat that ultrasonic treatment has no effects on enzymatic browning substrates and products，while potato PPO activity is significantly inhibition treated by different ultrasonic treatment conditions. PPO activity decrease to 54.21% of the original treated by ultrasound at power of 600 W for 90 min. It indicates that the inhibition of ultrasound on enzymatic browning of fresh- cut potato is realized by inhibiting the enzyme activity of related enzymes.

Key words：fresh- cut potato；enzymatic browning；ultrasonic treatment；PPO

*通訊作者：朱傳合（1978—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ?/p>

作者簡(jiǎn)介：楊明冠（1992—），男，碩士，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ?/p>

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ZR2012CM038）；國(guó)家“十二五”科技支撐項(xiàng)目（2012BAK17B05）。

收稿日期：2016- 02- 14

文章編號(hào)：1671- 9646（2016）03b- 0001- 05

中圖分類號(hào)：TS255.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671- 9646（X）.2016.03.027