高金祥　刁匯玲　王雅寧　董　華　張曉敏　呂　敏　賈振華　劉益濤

1　濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科　濱州　256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

?

維生素E對(duì)抗環(huán)磷酰胺對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的毒性作用

高金祥1刁匯玲2王雅寧1董華1張曉敏1呂敏1賈振華1劉益濤1

1濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科濱州256603；2 濱州醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室

【摘要】目的研究維生素E抑制環(huán)磷酰胺所致腎小管上皮細(xì)胞毒性作用的影響。方法通過MTT和中性彗星實(shí)驗(yàn)，分別觀察環(huán)磷酰胺單獨(dú)或與維生素E聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)腎小管上皮細(xì)胞生存率及DNA損傷的作用。結(jié)果與對(duì)照組相比，1、3 mol/L環(huán)磷酰胺處理腎小管上皮細(xì)胞12 h后可顯著降低細(xì)胞生存率，并可造成細(xì)胞的DNA損傷(P<0.05)；與環(huán)磷酰胺處理組相比，1 mmol/L維生素E顯著降低了環(huán)磷酰胺致腎小管上皮細(xì)胞DNA損傷的作用(P<0.05)，但對(duì)環(huán)磷酰胺降低腎小管上皮細(xì)胞生存率的作用無明顯影響(P>0.05)。結(jié)論維生素E對(duì)抗環(huán)磷酰胺致腎小管上皮細(xì)胞DNA損傷的作用。

【關(guān)鍵詞】環(huán)磷酰胺；維生素E；腎小管；上皮細(xì)胞

近年來環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)在臨床上廣泛應(yīng)用于對(duì)激素依賴或?qū)に氐挚沟哪I病綜合征、狼瘡性腎炎等腎臟疾病[1，2]的治療。它在殺傷免疫細(xì)胞的同時(shí)，還降低了正常組織細(xì)胞的抗氧化能力，促進(jìn)自由基過量生成，以致于正常細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，因此尋求一個(gè)既能降低其副作用又不減低療效的方法已成為當(dāng)務(wù)之急。維生素E(vitamin E，VE)又稱生育酚，是臨床上常用的抗氧化藥物，可以清除自由基，阻斷脂質(zhì)過氧化，保護(hù)細(xì)胞和組織免受由自由基誘導(dǎo)的氧化損傷[3，4]。因此，VE與CTX聯(lián)合應(yīng)用極有可能降低了CTX對(duì)正常腎組織細(xì)胞的損傷作用。本研究應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)和中性彗星實(shí)驗(yàn)，觀察了VE對(duì)CTX所誘發(fā)的正常腎小管上皮細(xì)胞毒性效應(yīng)的保護(hù)作用，旨在為提高CTX藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與儀器人類腎小管上皮細(xì)胞株(HKC)，購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；小牛血清及RPMI 1640購(gòu)于Gibco公司；噻唑藍(lán)(MTT)和CTX購(gòu)自sigma公司；Leica 倒置熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司)；ELX-800酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司)；DYY-6D型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2MTT實(shí)驗(yàn)將2×107L-1 HKC懸液以200 /孔接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(0 mol/L CTX)、0.1、0.3、1、3、10 mol/L CTX處理組，每組有5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞孵育6、12和24 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值(A490nm)，進(jìn)而計(jì)算細(xì)胞存活率[5]。

1.3中性彗星試驗(yàn)HKC經(jīng)CTX處理后，細(xì)胞濃度調(diào)為6×1010L-1，制成三明治膠。用4?C細(xì)胞裂解液浸泡三明治膠內(nèi)細(xì)胞2 h，然后移至電泳槽內(nèi)，電泳30 min后鏡下觀察，comet score 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1不同濃度CTX對(duì)HKC存活率的影響如表1所示，與對(duì)照組相比，0.1 mol/L CTX對(duì)HKC無明顯毒性作用(P>0.05)；0.3 mol/L CTX處理細(xì)胞24 h后有較明顯的毒性作用(P<0.05)；1 mol/L CTX處理細(xì)胞12、24 h后，細(xì)胞存活率分別降為(87±7.42)%、(81±6.13)%；3、10 mol/L CTX在各個(gè)時(shí)間段都能明顯降低HKC的存活率(P<0.05)。據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，CTX對(duì)HKC存活率的影響具有時(shí)間、劑量效應(yīng)。本研究選出1、3 mol/LCTX作用細(xì)胞12 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1　不同濃度CTX對(duì)HKC存活率的影響

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05

2.2VE聯(lián)合CTX對(duì)HKC生存率的影響1和3 mol/L CTX處理HKC 12 h后，細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比明顯下降(P<0.05)，但VE與CTX聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞存活率比單獨(dú)應(yīng)用CTX無明顯變化(P>0.05)，這表明1 mmol/L VE不能顯著減低CTX對(duì)HKC的細(xì)胞毒性，見表2。

表2　VE降低了CTX對(duì)HKC生存率的抑制作用

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與CTX處理組相比，#P<0.05

2.3VE聯(lián)合CTX對(duì)細(xì)胞DNA損傷的影響如表3和圖1所示，1、3 mol/L CTX處理HKC 12 h后，彗尾長(zhǎng)度和有尾細(xì)胞百分比與對(duì)照組明顯增加。CTX與1 mmol/L VE聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，彗尾的長(zhǎng)度和有尾細(xì)胞百分比與CTX處理組相比明顯變短，但仍長(zhǎng)于對(duì)照組(P<0.05)，這表明VE降低了CTX對(duì)細(xì)胞DNA的損傷。

表3　VE降低了CTX損傷細(xì)胞DNA的作用

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與CTX處理組相比，#P<0.05

3討論

環(huán)磷酰胺是一種烷化劑，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)還具有免疫抑制的作用，因此在腎臟疾病的治療中得到了廣泛的應(yīng)用。它進(jìn)入體內(nèi)后可轉(zhuǎn)化為酰胺氮芥和丙烯醛，后者可破壞正常細(xì)胞氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)，所產(chǎn)生的自由基作用于DNA的脫氧核糖和堿基，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂及交聯(lián)[6]?？寡趸瘎￢E是否具有保護(hù)正常的腎臟組織免受CTX損傷的作用，成為本研究所關(guān)注的熱點(diǎn)。

本研究通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察到CTX對(duì)HKC的毒性作用具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。1、3 mol/L CTX處理細(xì)胞12 h后，HKC細(xì)胞存活率分別下降為(87±7.42)%、(85±5.23)%，與對(duì)照組相比具有顯著差異性。但是1、3 mol/L CTX與1 mmol/L VE聯(lián)合處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率與CTX單獨(dú)處理細(xì)胞

無明顯差異，這表明VE不能拮抗CTX對(duì)HKC的殺傷作用。

中性彗星實(shí)驗(yàn)又稱單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，它能根據(jù)相同的電泳條件下遷移的DNA量(有尾細(xì)胞百分比)和DNA遷移部分的遷移長(zhǎng)度(彗尾長(zhǎng)度)來測(cè)定單個(gè)細(xì)胞DNA損傷程度[7]。本研究通過中性彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1、3 mol/L CTX可導(dǎo)致HKC發(fā)生DNA損傷，1mmol/LVE降低了CTX對(duì)DNA的損傷，但是不能完全抑制CTX的損傷作用，這提示了VE可部分拮抗了CTX對(duì)HKC造成的DNA損傷作用。

綜上所述，VE可保護(hù)了正常的腎組織細(xì)胞免受CTX所誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷，其作用機(jī)制可能是VE作為脂溶性抗氧化劑，清除了CTX處理HKC后所產(chǎn)生的自由基和脂質(zhì)過氧化物，降低了后者所造成的細(xì)胞DNA損傷，但VE具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)

[1] Larkins N,Kim S,Craig J,et al.Steroid-sensitive nephrotic syndrome:an evidence-based update of immunosuppressive treatment in children[J].Arch Dis Child,2015,pii: archdischild-2015-308924.[Epub ahead of print]

[2] Tian S Y,Feldman B M,Beyene J,et al.Immunosuppressive Therapies for the Maintenance Treatment of Proliferative Lupus Nephritis:A Systematic Review and Network Metaanalysis[J].J Rheumatol,2015,42(8):1392-1400.

[3] Zhang P Y,Xu X,Li X C.Cardiovascular diseases:oxidative damage and antioxidant protection[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2014,18(20):3091-3096.

[4] Momeni H R,Eskandari N.Effect of vitamin E on sperm parameters and DNA integrity in sodium arsenite-treated rats[J].Iran J Reprod Med,2012,10(3):249-256.

[5] Zhou C,Li Z,Diao H,et al.DNA damage evaluated by gammaH2AX foci formation by a selective group of chemical/physical stressors[J].Mutat Res,2006,604(1-2):8-18.

[6] Rehman M U,Tahir M,Ali F,et al.Cyclophosphamide-induced nephrotoxicity,genotoxicity,and damage in kidney genomic DNA of Swiss albino mice:the protective effect of Ellagic acid[J].Mol Cell Biochem,2012,365(1-2):119-127.

[7] Olive P L,Banáth J P.Growth fraction measured using the comet assay[J].Cell Prolif,1992,25(5):447-457.

Vitamin E inhibits the toxic effects of cyclophosphamide on human kidney tubular epithelial cell

GAO Jinxiang1DIAO Huiling2WANG Yaning1DONG Hua1ZHANG Xiaomin1LYU Min1JIA Zhenhua1LIU Yitao1

1 Department of Nephrology,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603,P.R.China;2 Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University

【Abstract】ObjectiveTo study the inhibitory action of vitamin E for the toxic effects of cyclophosphamide (CTX) on human kidney tubular epithelial cells (HKCs).MethodsMTT assay and neutral comet assay were separately used to observe the effect of CTX alone and in combine with vitamin E on the survival rate and DNA damage of HKCs.ResultsAfter 12h treatment, 1,3 mol/LCTX inhibited proliferation of HKCs and induced DNA damage of HKC (P<0.05) in comparison with control group.Compared with CTX treated group,Vitamin E decreased DNA damage induced by CTX (P<0.05).In addition,VE didn't change the HKC death induced by CTX (P>0.05).ConclusionsVE could inhibit the DNA damage of HKC induced by CTX.

【Keywords】cyclophosphamide,vitamin E,kidney tubule,epithelial cell

(收稿日期：2016-02-23 )

【中圖分類號(hào)】R692

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1001-9510(2016)02-0109-03

基金項(xiàng)目：濱州醫(yī)學(xué)院校級(jí)科技計(jì)劃(BY2009KJ38)

高金祥,E-mail：gjx751012@163.com