楊登路，雷幫星，康冀川*，韓　龍1,

(1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué) 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

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馬鈴薯早疫病拮抗菌株篩選及其抗菌活性

楊登路1,2，雷幫星2，康冀川2*，韓龍1,2

(1. 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學(xué) 西南藥用生物資源教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

摘要：為更加有效地利用微生物資源控制馬鈴薯早疫病，采用平板對峙法，篩選馬鈴薯早疫病病原菌的拮抗菌株，通過含毒介質(zhì)法探究拮抗菌株的抗菌活性。結(jié)果表明：44個供試內(nèi)生真菌和細(xì)菌的菌株中，7株細(xì)菌對馬鈴薯早疫病病原菌有顯著的抑菌作用，其中菌株H3的拮抗能力最強(qiáng)，采用平板對峙法顯示，菌株H3對馬鈴薯早疫病病原菌抑菌寬度為5.50 mm；對H3培養(yǎng)基類型進(jìn)行篩選，含毒介質(zhì)法顯示LB發(fā)酵液的抑菌活性最高，16.7%的H3發(fā)酵液的抑制率為71.17%；菌株H3發(fā)酵液能導(dǎo)致馬鈴薯早疫病病原菌菌絲形態(tài)變化：菌絲頂端出現(xiàn)空泡狀的膨大，菌絲隔間細(xì)胞變粗變短，原生質(zhì)收縮。結(jié)果說明H3可以拮抗馬鈴薯早疫病病原菌。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯早疫??；菌株H3；拮抗菌株；抑菌活性

馬鈴薯是僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物。貴州是中國馬鈴薯生產(chǎn)大省，也是中國馬鈴薯種植最早的省份之一[1,2]。2010年馬鈴薯種植面積為645840 hm2，種植面積位居全國第一[3]。

馬鈴薯早疫病是一種對馬鈴薯危害比較嚴(yán)重的病害，在世界范圍普遍發(fā)生，尤其在發(fā)展中國家被認(rèn)為是僅次于晚疫病的第二大馬鈴薯病害。該病害由茄鏈格孢(Alternaria solani Sorauer)引起，以危害葉片為主，同時危害葉柄、莖和塊莖。因病原菌侵染葉片和損傷塊莖，造成馬鈴薯減產(chǎn)和儲藏期的腐爛。在馬鈴薯早疫病的防治方法中，主要采取選擇抗病品種、農(nóng)業(yè)栽培措施和化學(xué)農(nóng)藥防治等措施。目前，在防治措施中以化學(xué)防治為主，但問題是農(nóng)藥殘留危害人、畜健康，污染土壤和水體，破壞生態(tài)平衡[4]。因此，具有無毒、無害、無污染、不產(chǎn)生抗藥性的生物防治技術(shù)，比較符合人們對綠色食品的需求，并且為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供了保障。利用微生物及其代謝產(chǎn)物控制植物病害已有許多成功的報道，但對馬鈴薯早疫病的研究還不多見[5]。

本文通過對馬鈴薯早疫病拮抗微生物菌株進(jìn)行篩選以及對拮抗菌株發(fā)酵液的抑菌效果進(jìn)行研究，為清楚該菌株對馬鈴薯早疫病防病機(jī)理和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

35株青蒿內(nèi)生真菌，由貴州大學(xué)生化工程中心實驗室分離保存。9株細(xì)菌由貴州大學(xué)生化工程中心分離保存，經(jīng)鑒定，H3菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。馬鈴薯早疫病菌(Alternaria solani Sorauer)，購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(菌株編號：37458)。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1種子培養(yǎng)基葡萄糖10 g、蛋白胨5 g、酵母膏5 g、NaCl 10.4 g、KH2HPO40.03 g、CaCl20.02 g、MgSO4·7H2O 0.02 g，pH7.0～7.2，121℃、0.1 MPa滅菌30 min。

1.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1%葡萄糖、0.3% K2HPO4、2% 酵母粉、pH 7.0～7.4)、BPY培養(yǎng)基[6]。

1.2.3馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基將馬鈴薯洗凈去皮切碎，稱取200 g加水1000 mL煮沸，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和18 g瓊脂，分裝，121℃滅菌20 min。

1.3方法

1.3.1 拮抗菌株的篩選

采用平板對峙法測定供試菌株對馬鈴薯早疫病病原真菌的抑菌作用。細(xì)菌：在PDA平板中央接種病原真菌,四周接種拮抗細(xì)菌,以不接種細(xì)菌的作為對照;真菌：在PDA平板兩側(cè)分別接種供試真菌和病原菌，相距2.0 cm，以不接種供試真菌作為對照[7]。重復(fù)三次，置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)對照組病原真菌長至培養(yǎng)皿邊緣時,觀察并記錄實驗組有無抑菌圈產(chǎn)生并測量抑菌圈直徑。

1.3.2菌株H3發(fā)酵液制備

(1)菌種活化：將4℃冰箱內(nèi)斜面保存的菌株H3通過劃線法接種于LB上，30℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2-3次。

(2)發(fā)酵液的制備：將已活化的菌株H3接種于裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中(三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基的裝液量為40%)，150 r/min，30℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h。2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上，得到發(fā)酵液，將發(fā)酵液于高速離心機(jī)內(nèi)4500 r/min離心15 min，收集上清液在微孔濾膜過濾器中過濾，得菌株H3發(fā)酵液，備用。

1.3.3含毒介質(zhì)法探究拮抗菌株的抗菌活性

將發(fā)酵液與培養(yǎng)基以1∶5體積比混合。以加等量的無菌水的培養(yǎng)基為對照，采用含毒介質(zhì)法(生長速率法)測定其抑菌效果。計算方法如下：

D=D1-D2×I=(D0-D)/D0×100%

D-菌落增長直徑，I-菌絲生長抑制率，D1菌落直徑，D0-空白對照菌落增長直徑，D2-菌餅直徑。

1.3.4檢測拮抗菌發(fā)酵濾液對病原菌形態(tài)的影響

將活化的病原真菌接種于PDA固體培養(yǎng)基中央，28℃下培養(yǎng)48 h后在菌落邊緣用6 mm直徑打孔器打孔，菌株H3的發(fā)酵液注入孔內(nèi)，每孔100 μL，用未接菌的LB液體培養(yǎng)基作空白對照，每處理3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)48 h，挑取抑菌帶邊緣的馬鈴薯早疫病病原菌菌絲，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)[9]。

1.3.5不同培養(yǎng)基對菌株H3抗菌活性的影響

將拮抗菌株H3活化后用接種環(huán)挑取菌株單菌落接入種子培養(yǎng)基中，裝液量100 mL(250 mL三角瓶)、初始pH 7.0，30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。以2%接種量分別接種到馬鈴薯液體培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基，空白對照接種無菌水，30℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h。取20 ml發(fā)酵液加入到100 ml PDA中(1∶5)，通過含毒介質(zhì)法檢測不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抗菌活性。

1.3.6不同濃度發(fā)酵液對早疫病病原菌的抗菌活性

以篩選出的液體培養(yǎng)基LB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在體系為100 ml的PDA中加入不同量的發(fā)酵液，使發(fā)酵液的濃度分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%，通過含毒介質(zhì)法測定不同濃度發(fā)酵液的抗菌活性。

2結(jié)果與分析

2.1不同菌株對馬鈴薯早疫病的拮抗能力

供試的青蒿內(nèi)生真菌中，通過平板對峙法沒有與病原菌產(chǎn)生抑菌圈的現(xiàn)象，說明青蒿內(nèi)生菌對馬鈴薯早疫病無明顯的拮抗作用。供試的細(xì)菌中有7株細(xì)菌有明顯的抑菌作用(表1)，菌株H3對馬鈴薯早疫病病原菌的抑制作用最好，抑菌寬度5.50 mm。(如圖1)。

表1　9株細(xì)菌對馬鈴薯早疫病病原菌的抑制作用

圖1　菌株H3對馬鈴薯早疫病病原菌的平板對峙試驗

2.2拮抗菌發(fā)酵濾液對病原菌的影響

挑取空白對照孔和發(fā)酵菌液孔周邊的菌絲分別在體式鏡和顯微鏡下觀察。體式鏡下，正常菌絲分布均勻，平鋪在培養(yǎng)基上，發(fā)酵液周圍菌絲，厚而致密，棉絮狀纏繞在一起。顯微鏡下正常菌絲光滑、透明、粗細(xì)均勻，原生質(zhì)分布均勻。抑制菌絲頂端出現(xiàn)空泡狀的膨大，菌絲隔間變粗變短，細(xì)胞原生質(zhì)濃縮(圖2)。

圖2　H3發(fā)酵液對病原菌菌絲的影響

2.3不同培養(yǎng)基發(fā)酵液的抗菌活性

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LB、NB、PDB、BPY發(fā)酵液的抑菌率分別為40.78%、71.17%、65.00%、69.35%、70.12%(表2)。對于不同培養(yǎng)基，H3產(chǎn)生的物質(zhì)存在差異性而且對馬鈴薯早疫病的抗菌活性差異顯著。以上培養(yǎng)基中LB液體培養(yǎng)基最有利于抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生。

表2　菌株H3的不同培養(yǎng)基發(fā)酵液對早疫病病原菌的抑制率

注：結(jié)果為平均值c標(biāo)準(zhǔn)誤，同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示各處理間差異顯著(p<0.05)。

圖3　H3不同培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性(a.空白；b.PDB；c.NB；d.BPY；e.LB；f.發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基)Fig.3　Antimicrobial activity of strainH3 in differentculture brothagainst Alternaria solani

2.4不同濃度發(fā)酵液對早疫病病原菌的抗菌活性

以篩選出的LB液體培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵液濃度為10%、20%、30%時，抑制率分別為78.48%、80.06、80.38%，沒有顯著差別。當(dāng)發(fā)酵液濃度到達(dá)40%以上時，抑菌率才有明顯的提高。說明可能在40%以下的濃度時，抑菌物質(zhì)的量還不能夠累計到達(dá)一定的量引起抑菌率的變化。當(dāng)發(fā)酵液濃度到達(dá)60%時，抑菌率基本到達(dá)100%。

表4　不同濃度梯度發(fā)酵液的抑菌率

圖4　不同濃度發(fā)酵液抑菌效果

3結(jié)論與討論

茄鏈格孢菌在自然界寄主種類多，分布廣泛，常形成不同的生態(tài)類型,即使分離自同一寄主植物的不同菌株之間也往往在生物學(xué)性狀與致病力方面存在顯著差異[13]。分離自馬鈴薯的茄鏈格孢的相關(guān)文獻(xiàn)并不多，分離自其他作物的茄鏈格孢菌研究較多,包括對生物學(xué)性狀、致病力、產(chǎn)孢條件、抗病育種、化學(xué)防治等均有較多報道[10],對其拮抗菌的篩選也已有報道[5，10，11]。目前對于馬鈴薯早疫病菌多樣性、生物學(xué)特性、致病力分化及其侵染過程已有相關(guān)文獻(xiàn)報道[12-13]。但是枯草芽孢桿菌作為生防菌對馬鈴薯早疫病的研究也還不多見[5]。

該試驗從保存具有廣譜性抗菌的內(nèi)生真菌和細(xì)菌的44個菌株中，篩選出的菌株H3。經(jīng)鑒定，菌株H3為枯草芽孢桿菌(B. Subtilis)對馬鈴薯早疫病具有良好的抗菌活性。通過平板對峙法，菌株H3的抑菌寬度為5.50 mm。LB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的H3發(fā)酵液(發(fā)酵液∶培養(yǎng)基=1∶5)的抑菌率為71.17%。通過平皿打孔抑菌試驗可以發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液對菌絲具有抑制作用，并且改變了菌絲的形態(tài)：抑制菌絲厚而致密，棉絮狀纏繞在一起，抑制菌絲頂端出現(xiàn)空泡狀的膨大，菌絲節(jié)間變粗變短，原生質(zhì)收縮。這些現(xiàn)象都表明其細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)受到了破壞,可見發(fā)酵液對茄鏈格孢細(xì)胞壁的損傷是明顯的，細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡也表明細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)也遭到破壞。因此，發(fā)酵液在破壞外層細(xì)胞壁后,也使細(xì)胞質(zhì)中的物質(zhì)基礎(chǔ)如脂質(zhì)體等發(fā)生變化或者損傷,最終達(dá)到抑制效果。這與唐福星[14]等用山蒼子精油處理黑曲霉(Aspergillus nigervan)可干擾其細(xì)胞壁的生長，阻斷代謝途徑，最終達(dá)到抑菌效果的觀點相同?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)主要為低分子抗菌肽，包括分子量約在1000 Da的環(huán)狀肽、環(huán)狀脂肽和線狀肽，也有些大分子的蛋白類拮抗物[15]，抗菌物質(zhì)的確定需要進(jìn)一步研究。本文對篩選出的菌株H3對馬鈴薯早疫病的抗菌活性進(jìn)行初步探究。隨著進(jìn)一步對菌株H3發(fā)酵優(yōu)化以及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，菌株H3對于馬鈴薯早疫病的拮抗作用必將得到提升。研究表明菌株H3可以作為馬鈴薯早疫病的生防菌，值得深入研究。

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The Screening of Antagonistic Strains to Potato Early Blight and Detection of Antimicrobial Activity

YANGDeng-lu1,2,LEIBang-xing2,KANGJi-chuan2*,HANLong2

(1.CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.EngineeringResearchCenterofSouthwestBio-PharmaceuticalResources,MinistryofEducation,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:In order to control potato early blight by microorganisms, plate confrontation tests were used to screen antagonistic strains, then the antimicrobial activity were detected in the current work. Among the 44 strains of endophytic fungi and bacteria, seven bacterial strains gave a significantly inhibitory effect against pathogen, off which strains H3 demonstrated the highest antagonistic ability, whose antibacterial circle diameter was 5.50mm. Antimicrobial activity of strain H3 broth in LB was the highest, and strain H3 broth with 16.7% concentration gave 71.17% inhibition rate. Strain H3 broth cause the abnormality of pathogenmycelium, i.e. the apical expansion to vacuole-like sphere, the thicker and shortersection between hyphaeseptum, as well as the shrinked protoplast. Therefore, strain H3 could better control potato early blight.

Keywords:Potato early blight；Strain H3；Antagonistic strains；Antimicrobial activity

文章編號：1008-0457(2016)01-0062-05國際DOI編碼：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.013

中圖分類號：S571.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

*通訊作者：康冀川，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：分子生物學(xué)和真菌學(xué)；E-mail:bcec.jckang@gzu.cn。

基金項目：貴州省農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目“植物內(nèi)生菌抗馬鈴薯真菌病害及其生防制劑的研究”黔科合NY[2013]3042號。

收稿日期：2016-02-15；修回日期：2016-02-07