唐千捷，鐘詩龍，林浩銘，李夏寅，何國東，韓雅玲，王來友

(1.廣東藥科大學 藥科學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學研究部，廣東 廣州 510080； 3.孫逸仙紀念醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510120； 4.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內科，遼寧 沈陽 110000)

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MicroRNAs表達與藥物代謝酶CYP2C19活性相關性研究

唐千捷1，鐘詩龍2，林浩銘3，李夏寅2，何國東2，韓雅玲4，王來友1

(1.廣東藥科大學 藥科學院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學科學院 醫(yī)學研究部，廣東 廣州 510080； 3.孫逸仙紀念醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510120； 4.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內科，遼寧 沈陽 110000)

摘要:目的 探討肝組織MicroRNAs (miRNA)與CYP2C19代謝酶活性的相關性。方法 通過基于LC/MS/MS的“Cocktail”探針藥物法檢測人肝S9中CYP2C19等4種代謝酶活性；運用生物信息學預測軟件選擇5個作用于CYP2C19 mRNA的miRNA以及1個作用于CYP3A4 mRNA的miRNA作為陰性對照，并用qRT-PCR方法檢測其在肝組織中的表達水平，分析miRNA表達量與酶活性的關系。結果 在6個miRNAs中，miR-130a(r=-0.476 2，P<0.05)和miR-142(r=-0.400 8，P<0.05)在肝臟中的表達水平與CYP2C19酶活性顯著負相關。結論 miRNA的表達水平可能是影響人群中CYP2C19酶活性變化差異的重要因素之一。

關鍵詞:miRNA； CYP2C19； “Cocktail”探針藥物法； LC/MS/MS

細胞色素P4502C19(CYP2C19)是肝臟中P450多功能氧化酶系統(tǒng)的重要成員。CYP2C19參與了10%～15%臨床藥物的代謝過程[1-2]，包括質子泵抑制劑奧美拉唑，抗抑郁藥如氟西汀、丙咪嗪，抗癲癇藥物如安定、丙戊酸，以及抗血小板藥物氯吡格雷和抗瘧藥利福平等[3]。對人體而言，CYP2C19蛋白由CYP2C19基因編碼[4]。大量的研究表明，遺傳變異、內源性因素和環(huán)境因素影響了CYP2C19的表達和作用功能：在427例人群研究中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因遺傳變異引起的CYP2C19 mRNA表達及其蛋白活性變化存在800倍的差異[5]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)CYP2C19*1～CYP2C19*35突變等位基因，致使CYP2C19酶的功能降低甚至缺失[6-7]。CYP2C19基因遺傳變異不僅調控CYP2C19酶活性，而且也影響它的抑制和誘導，為臨床精準用藥帶來了很大困難。

然而，當前的基因多態(tài)性等遺傳變異研究還不能充分解釋CYP2C19酶活性的多態(tài)性變化，表觀遺傳學MicroRNA(miRNA)轉錄后調控提供了研究者們新的關注視角。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠直接或間接地影響編碼CYP450酶相關基因的表達，從而調控酶活性[9]。Pan等[10]研究證明miR-27b能直接作用于CYP3A4 mRNA 3′-UTR來調節(jié)CYP3A4代謝酶的活性。目前關于miRNA對CYP2C19活性影響的研究尚少，僅有Yu等[12]報道的miR-29b能夠調控CYP2C19 mRNA在肝細胞株和肝組織的表達。

除了已報道的miRNA外，還可能存在其他miRNA能夠對CYP2C19酶活性產生影響。本研究通過運用課題組已研究過的“Cocktail”探針藥物法檢測獲得肝S9中CYP2C19活性，從生物信息學角度，在人體肝臟水平探討miRNA是否可以影響CYP2C19酶活性變化。

1儀器與試藥

1.1儀器

LC-20高效液相色譜儀(日本島津公司)；API 4000 Qtrap三重串聯(lián)四極桿質譜儀、電噴霧電離源ESI(美國AB Sciex公司)；Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；C18XB分析柱(3 μm，150×2.1 mm，大連依利特)；Beckman GS-6R離心機、Beckman-Coulter AllegraTM64R冷凍高速離心機(美國Beckman 公司)；BP110S型電子分析天平(德國Sartorius公司)；Mili Q-plus 超純水凈化系統(tǒng)(美國Billerica公司)；NanoDrop2000分光光度計(美國Thermo公司)；MJ Research PTC-200 PCR儀(美國MJ Research公司)；Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2主要試劑

標準品試劑：奧美拉唑、5-羥基奧美拉唑、氯唑沙宗、6-羥基氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、4-羥基甲苯磺丁脲、α-羥基咪達唑侖、格列齊特標準品(均為99%)購自美國Sigma公司；咪達唑侖標準品(98%)購自江蘇恩華藥業(yè)；甲醇、乙腈為色譜純，購自德國默克公司；水為超純水；乙酸乙酯及其他化學試劑為國產分析純。

miRNA提取定量試劑：GENMED組織清洗液及勻漿液購自美國Genmed公司；Trizol Reagent購自美國Life公司；RNase Free Water和RNAlater儲存液購自德國Qiagen公司；逆轉錄PrimeScriptRTKit購自日本Takara公司；iTaq Universl SYBR Green supermix購自美國Bio-Rad公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物購自廣州銳博公司。

2方法

2.1肝組織樣本收集

收集2012年9月至2015年5月中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院25例肝臟標本(其中包括13例肝癌標本)，男性為18例，所有肝組織患者年齡范圍為32～70歲，并考察性別、年齡、苯巴比妥用藥、肝癌和乙肝疾病對結果的影響。樣本搜集嚴格遵循醫(yī)學倫理原則，獲醫(yī)院倫理委員會批準，均獲得患者家屬知情同意。在外科手術中取患者的部分肝組織，放入預裝1.5 mL RNAlater儲存液的離心管中，并于-80 ℃冰箱長期保存。另外剩余肝組織剪碎后用GENMED清理液A清洗3～4次，裝入凍存管中置于液氮罐中備用。

2.2制備肝S9方法

從液氮罐中取出凍存的肝組織，迅速稱質量，移入研缽中，倒入液氮研磨成粉末，移至預冷的玻璃勻漿器中，按1∶4(W∶V)加入GENMED勻漿液B，在冰上抽提勻漿，將液體轉移至離心管中，9 000 g、4 ℃離心20 min，取上清液，在冰上分裝至預冷的凍存管中，置液氮罐中保存。運用Braford法對肝S9蛋白含量進行檢測。

2.3酶活性檢測孵育體系及樣品前處理(“Cocktail”探針藥物法)

取人肝S9組分適量(1 mg/mL)，0.4 mol/L MgCl22 μL，1.65 mol/L KCl 2 μL，250 mg/mL 6-磷酸葡萄糖單鈉鹽(G-6-PNa)1.2 μL，100 mg/mL NADP 6 μL，100 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PDH)2 μL，磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)100 μL，混合探針底物適量(氯唑沙宗/奧美拉唑/甲苯磺丁脲/咪達唑侖終質量濃度均為50 ng/mL)，去離子水補足至200 μL。

孵育一定時間后加入1 000 μL乙酸乙酯終止反應，再加入200 ng/mL格列齊特內標工作液10 μL，漩渦震蕩3 min，靜置10 min，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，吸取上層有機相至另一離心管中，在真空干燥器中揮干。殘渣用50%甲醇(V∶V)100μL復溶，渦旋1min，在4 ℃下12 000r/min離心5min，取上清加入96孔板，進樣3μL。本實驗對專屬性、準確度、精密度、回收率、穩(wěn)定性和基質效應進行了考察。

2.4色譜和質譜條件

色譜條件：正離子和負離子流動相均為乙腈∶水(含0.1%甲酸)(80∶20，V∶V)，流速為0.25 mL/min，柱溫為20 ℃。分析時間均為5 min。質譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI+或ESI-)；電噴霧電壓正離子模式為5 500 V，負離子模式為4 500 V；加熱毛細管溫度為450 ℃；鞘氣(N2)壓力為15 psi，輔助氣(N2)壓力為1 psi，碰撞氣(N2)壓力為1.0 mTorr；掃描峰寬為0.7 Th；掃描時間為200 ms，掃描方式為多反應檢測掃描(MRM)。

2.5miRNA的預測和選擇

運用TargetScan、miRanda、miRBase和RNA22計算機軟件庫預測到了具有潛在的靶向作用于CYP2C19的miRNA，并選擇hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-206、hsa-371b-5p、hsa-miR-491-3p這5個miRNA作進一步研究，同時選擇了靶向作用于CYP3A4 mRNA的miR-27b作為陰性對照。

2.6組織miRNA提取及定量方法

從RNAlater中取出1/3綠豆大小肝組織并經液氮研磨后，用Trizol-氯仿法(5∶1)萃取上清，并加入等體積異丙醇，離心后用75%(φ)乙醇漂洗2次，晾干EP管，并用25 μL RNase free Water溶解即得。取2 μL RNA樣品進行NanoDrop2000檢測，記錄濃度與A260/280。采用stem-loop qRT-PCR方法檢測miRNA表達水平，以sh RNA U6為內參基因標準化不同組織樣品量差異。逆轉錄體系按照Takara RR037試劑盒說明書，使用RNA 模版1 μg，于MJ Research PCR(PTC-200)儀上完成，程序為42 ℃ 60 min，79 ℃ 10 min，4 ℃保存。熒光定量PCR體系為10 μL，其中iTaq Universl SYBR Green supermix 5 μL，F(xiàn)orward/Reverse Prime(5 μmol/L)各1 μL，cDNA1 μL，RNase Free Water 2 μL。Bio-Rad PCR儀反應程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40個循環(huán)，以及溶解曲線。miRNA相對表達量=2-△Ct，△Ct=Ct目的基因-CtU6。

2.7統(tǒng)計分析

應用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，Shapiro-Wilk normality test分析樣本數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布，用多重線性回歸分析臨床基線資料與miR-130a、miR-142和CYP2C19活性的影響關系，運用Sperman correlation分析變量之間是否具有相關性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

3.125例肝組織樣本臨床基線資料

表1顯示了25例肝組織病例臨床基線資料。多重線性回歸分析結果說明，病例性別與年齡的變化與肝組織miR-130a、miR-142的表達水平沒有相關性(P>0.05)。服用巴比妥類藥物對實驗結果沒有顯著影響(P>0.05)。另外，肝癌和乙肝疾病對實驗結果也無直接影響(P>0.05)。

3.2液質聯(lián)用檢測酶活性結果

針對CYP2C19酶活性檢測，以反應時間為橫坐標，以探針底物奧美拉唑的代謝產物5-羥基奧美拉唑濃度為縱坐標，繪制反應曲線，見圖1。奧美拉唑反應速度由快減慢，5-羥基奧美拉唑生成量在0～120 min呈線性平穩(wěn)上升，之后反應速率趨于穩(wěn)定。25例肝組織樣品間CYP2C19酶活性從0.46～16.2(nmol·min-1·mg-1)變化差異較大，其頻率分布直方圖見圖2。

表125例肝組織患者臨床基線資料以及其對miR-130a、miR-142表達和CYP2C19活性的影響

Table 1Relationship between general characteristics and miR-130a and miR-142 expression and CYP2C19 activity in 25 liver tissues

基本特征n(%)或x±smiR-130a表達BPmiR-142表達BPCYP2C19活性BP性別(男)18(72.0)-6.3460.81845.2060.3440.0050.869年齡50.68±10.3726.3970.085544.6490.619-0.0660.920使用苯巴比妥類藥物19(82.6)0.0660.99819.9030.636-0.0010.998肝癌13(52.0)-42.5670.15214.6570.769-0.0190.528乙肝11(78.6)10.6210.75912.3030.8820.0110.735

98765432102004006008000t/minBA76543210100150500ρ/(ng?mL-1)ρ/(ng?mL-1)

A. 0～720 min； B. 0～120 min。

圖15-羥基奧美拉唑的反應曲線

Figure 1Response curve of 5-hydroxyomeprazole (n=5)

3.3miRNA表達與CYP2C19活性關系

所選的6個miRNAs都處于可檢測水平，但是miR-371、miR-206和miR-491的表達水平均低于其他miRNAs(見圖3)。在這6個miRNAs中，miR-130a和miR-142的表達水平與CYP2C19酶活性呈顯著負相關關系(miR-130a:r=-0.476 2，P<0.05，95%CI=-0.739 0～-0.087 45；miR-142:r=-0.400 8，P<0.05，95%CI=-0.693 6～0.005 761)。但是，miR-491、miR-206和miR-371的表達與CYP2C19酶活性關系相對穩(wěn)定，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。陰性對照miR-27b在肝臟中表達量與CYP2C19酶活性關系相對穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

86420頻數(shù)101214161802468CYP2C19活性/(nmol?min-1?mg-1)

圖2CYP2C19酶活性頻數(shù)分布圖(n=25)

Figure 2Frequency distribution of CYP2C19 enzyme activity

20-2-4-6-8miRNA相對表達量miR-27b130a142371491206

圖3所選相關miRNAs在肝組織中的表達水平(n=25)

Figure 3Expression of selected relative miRNAs in human liver tissues

miRNA相對表達量2.01.51.00.50?10-42.01.51.00.50?10-5miRNA相對表達量4.03.02.01.00?10-50.150.100.050.00miR-142miR-491miR-27bmiR-371miR-206miR-130ar=-0.3138P>0.05r=-0.4762P<0.05r=-0.4008P<0.05r=-0.2223P>0.05r=-0.3423P>0.05r=-0.2223P>0.052.52.01.51.00.50?10-22.01.51.00.50?10-2CYP2C19酶活性05101520CYP2C19酶活性05101520CYP2C19酶活性05101520

圖4miRNA與CYP2C19酶活性的相關性分析結果

Figure 4Correlation between miRNA expression and CYP2C19 enzyme activity (n=25)

4討論

細胞色素P450是人體內最重要藥物代謝酶系，目前關于miRNA與P450酶作用的相關分析尚不充分。本研究運用生物信息學方法預測并選擇檢測靶向作用于CYP2C19基因的miRNA，是首次在中國人群中進行miRNA與肝藥酶CYP2C19活性的相關研究。

對25例肝組織樣本的臨床基線資料統(tǒng)計分析，說明了本研究納入的病例患者年齡、性別、苯巴比妥用藥、肝癌和乙肝疾病因素對實驗結果均無影響。肝組織體外代謝奧美拉唑的產物5-羥基奧美拉唑反應曲線顯示，在0～120 min孵育時間內，60 min時反應速率最快，因此體外孵育的最佳反應時間為60 min。所有肝組織CYP2C19酶活性變化存在35倍差異，頻數(shù)分布較分散，反映了肝組織病例間CYP2C19代謝酶活性個體差異較大。

實驗發(fā)現(xiàn)，miR-130a和miR-142與CYP2C19酶活性呈顯著負相關關系，提示了miRNA可能是影響CYP2C19酶活性差異的重要因素之一。TargetScan數(shù)據(jù)庫預測顯示，miR-130a和miR-142能分別與CYP2C19 mRNA 3′-UTR(ENST00000371321.3)2371-2377和2555-2561位點的種子序列結合，可能通過引起mRNA切割或翻譯抑制，從而在轉錄后水平干擾CYP2C19靶基因的蛋白質，對CYP2C19酶活性起到負調節(jié)作用。而且，有研究稱miR-130b可能抑制CYP2C19蛋白的表達，而miR-130a與miR-130b屬于同家族miRNA，具有高度的同源性，可能對它們的靶基因和蛋白具有共同的抑制作用[13]。

另外，miR-371、miR-206和miR-491與CYP2C19酶活性無顯著相關性，可能是由于它們在肝臟的表達水平均遠低于其他miRNA，對CYP2C19酶活性產生的抑制作用較弱，因此與其活性的相關性低。而作為陰性對照的靶向作用于CYP3A4 mRNA的miR-27b的表達與CYP2C19酶活性無顯著相關性，說明實驗結果有效可靠。但本研究仍然存在一定的局限性，今后的實驗應該收集納入更多的樣本，并進一步驗證miRNA對CYP2C19基因和蛋白表達的作用機制。

綜上所述，在人體肝組織中的miR-130a、miR-142與CYP2C19代謝酶活性具有負相關作用，miRNA的表達水平可能是影響人群中CYP2C19酶活性變化差異的重要因素之一。

明確CYP2C19代謝酶的遺傳缺失因素，將有利于臨床上個體化用藥，減少藥物不良反應，預測患者對藥物的反應性，從而提供最安全有效的精準藥物治療。

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(責任編輯：幸建華)

Relationship between microRNAs expression and drug metabolism enzyme CYP2C19 activity

TANG Qianjie1,ZHONG Shilong2,LIN Haoming3,LI Xiayin2,HE Guodong2,HAN Yaling4,WANG Laiyou1(1.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity;GuangdongMetabolicDiseasesResearchCenterofIntegratedChineseandWesternMedicine,Guangzhou510006,China; 2.MedicalResearchCenterofGuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China; 3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China; 4.CardiovascularMedicineofGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110000,China)

Abstract:Objective To investigate the correlation between miRNAs expression and cytochrome CYP2C19 enzyme activity in liver tissues. Methods The activities of four metabolic enzymes in liver S9 fraction including CYP2C19 were determined by cocktail drug probe approach based on LC/MS/MS. Five potential miRNAs targeting CYP2C19 mRNA and one negative miRNA targeting CYP3A4 mRNA were chosen by bioinformatics software. The levels of these miRNAs in liver were determined by qRT-PCR. The relevance between miRNAs expression and metabolic enzyme activities was analyzed. Results Among the six miRNAs,miR-130a (r=-0.476 2,P<0.05) and miR-142 (r=-0.400 8,P<0.05) levels were negatively associated with the activity of CYP2C19. Conclusion miRNAs could be one of key factors that influence CYP2C19 activity in populations.

Key words:miRNA; CYP2C19; “cocktail” approach; LC/MC/MC

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015112602

中圖分類號:Q554

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)02-0243-07

作者簡介：唐千捷(1991—)，女，2013級碩士研究生；通信作者：王來友，男，博士，副教授，碩士研究生導師，主要從事藥物代謝動力學與代謝性疾病藥物研究，Email: wanglaiyou@gdpu.edu.cn。

基金項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAI11B07)；國家自然科學基金項目(81373486)；廣東省科技計劃項目(2013B021800157)；廣州市科技計劃項目(201510010236)；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項目(自然科學類)(2105KTSCX073)

收稿日期：2015-11-26

網(wǎng)絡出版時間：2016-03-29 10:16網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160329.1016.002.html