王金全，薄華本，陳啟助

(廣東藥科大學 廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

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新型釕配合物通過內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導Bel-7402細胞凋亡的機制

王金全，薄華本，陳啟助

(廣東藥科大學 廣東省生物技術(shù)候選藥物研究重點實驗室，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 研究釕配合物Ru-HMIP對肝癌細胞Bel-7402的抑制作用及其機制。方法 MTT法檢測Ru-HMIP對Bel-7402細胞的殺傷作用；流式細胞術(shù)檢測其誘導細胞凋亡情況；JC-1熒光探針檢測線粒體膜電位；DCFH-DA熒光探針檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)；Western blot檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果 Ru-HMIP對Bel-7402細胞有較強的殺傷效果；其對細胞毒性作用是通過誘導細胞凋亡方式；Ru-HMIP在Bel-7402細胞中產(chǎn)生過量ROS，并且這種作用及其細胞毒性都可被還原劑乙酰半胱氨酸(NAC)所阻斷。Ru-HMIP可以破壞Bel-7402細胞線粒體膜電位；上調(diào)Bax，下調(diào)Bcl-2，同時激活Caspase-9及Caspase-3。結(jié)論 Ru-HMIP可以在體外有效抑制Bel-7402細胞增殖，其作用機制是在細胞內(nèi)誘發(fā)過量ROS，繼而通過內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:釕配合物； Bel-7402細胞； ROS； 凋亡通路

肝癌是臨床最為常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升，每年全世界新增約63萬例肝癌患者[1]。目前肝癌的治療效果并不理想，且病死率高，所以亟需研發(fā)新的治療藥物。近些年，基于金屬釕的配合物由于具有更強的抗腫瘤活性和較低的系統(tǒng)毒性，成為最有可能應用于臨床的新一代金屬抗腫瘤藥物[2]。至今已經(jīng)有3種金屬釕抗腫瘤藥物NAMI-A、KP1019和NKP1339進入了臨床研究階段，并且得到了較好的研究結(jié)果[3]。釕配合物的抗腫瘤作用機制呈現(xiàn)多靶點和多機制的特點，其中包括抑制DNA拓撲異構(gòu)酶，產(chǎn)生活性氧(ROS)，蛋白激酶抑制，通過穩(wěn)定G-四鏈體DNA而抑制端粒酶活性等[4- 5]。本課題組前期設(shè)計合成并篩選出一系列具有高活性、相對低毒性的手性釕多吡啶配合物，它們對多種癌細胞表現(xiàn)出良好的殺傷活性，并且對正常肝細胞L02表現(xiàn)較低的毒性，有可能成為新型的選擇性化療候選藥物[6]。為了探明其抗瘤譜及研究相關(guān)作用機制，本次研究選取活性較好的釕配合物Ru-HMIP為研究對象，以人肝癌細胞Bel-7402為研究模型，探討Ru-HMIP對Bel-7402的抗腫瘤效果及相關(guān)作用機制，以期為肝癌的治療及Ru-HMIP的進一步研究和開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1主要材料、試劑及儀器

Ru-HMIP合成方法參照本課題組已發(fā)表文獻[6]，用DMSO配制成20 mmol/L儲備液，4 ℃存放備用。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone公司)；MTT、Annexin V-FITC/PI試劑盒、JC-1試劑盒、DCFH-DA(Invitrogen公司)；Western blot 抗體(Abcam公司)；其他常用生化試劑如PBS及蛋白提取試劑盒及測定試劑(碧云天生物科技公司)；550型酶標儀(Bio-rad，美國)；高速冷凍離心機(Eppendorf centrifuge 5430，美國)；倒置熒光顯微鏡(Zeiss Axio D1，德國)；FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences，美國)；Western blot小型電泳系統(tǒng)(Bio-rad mini，美國)。

1.2腫瘤細胞培養(yǎng)

肝癌細胞株Bel-7402為本實驗室保存。細胞置于37 ℃，5%(φ)CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中，在含有10%(φ)新生胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。如無特殊說明，實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3噻唑藍比色法(MTT法)檢測Ru-HMIP對Bel-7402細胞殺傷活性

實驗細胞置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中生長至對數(shù)期，0.25%胰酶消化收集細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，使細胞密度大約在1×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。換液，加入不同濃度的Ru-HMIP，每個濃度做3個平行樣，設(shè)置空白調(diào)零組(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，空白組(培養(yǎng)基、細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、MTT、DMSO)，繼續(xù)孵育24 h。吸去上清，每孔加入90 μL新鮮培養(yǎng)液，再加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5%MTT)，培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩30 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀檢測490 nm波長各孔的A值。相關(guān)的細胞增殖的抑制率及半數(shù)抑制濃度(IC50)用下面的公式進行計算：生長抑制率=(A對照-A實驗)/(A對照-A空白)，所有A值均減去空白調(diào)零組A值。將抑制率與藥物濃度作圖，得出劑量反應曲線，計算IC50值。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染檢測Ru-HMIP誘導Bel-7402細胞凋亡

收集Bel-7402細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，6孔板中每孔接種約2×105個細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。換液，加入不同濃度Ru-HMIP，孵育24 h。小心吸去上清，0.25%胰酶消化收集細胞，1 000 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μL PBS重懸，用濾網(wǎng)過濾。1 000 r/min，離心5 min，去上清，加入100 μL 1× Binding Buffer重懸細胞，分別加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI，室溫孵育15 min，加入400 μL 1× Binding Buffer，用FACSCanto II流式細胞儀上機檢測。

1.5細胞內(nèi)ROS檢測

收集Bel-7402細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，6孔板中每孔接種約2×105個細胞，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24 h。換液，加入不同濃度的Ru-HMIP及H2O2，孵育12 h。吸去上清，0.25%胰酶消化收集細胞，然后各孔加入10 μmol/L DCFH-DA熒光探針，37 ℃孵育30 min。離心去上清，PBS重懸，用FACSCanto Ⅱ流式細胞儀檢測分析，激發(fā)波長488 nm。為觀察ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)對Ru-HMIP誘發(fā)ROS或者細胞毒性的影響，另外設(shè)NAL干預組，在加入Ru-HMIP或者H2O2前1 h加入濃度為10 mol/L的NAC，孵育相應時間，流式細胞術(shù)檢測ROS，MTT法檢測細胞毒性。

1.6JC-1熒光染色檢測Ru-HMIP對Bel-7402線粒體膜電位影響

收集Bel-7402細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，將細胞接種于6孔板，每孔2 mL，每孔接種約2×105個細胞。置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。換液，加入不同濃度Ru-HMIP，每一個濃度設(shè)3個平行孔，同時設(shè)置加入相同濃度藥物溶解介質(zhì)的空白對照孔，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。吸出上清，PBS洗滌2次，加入500 μL JC-1工作液，37 ℃，室溫暗處孵育15 min，吸出工作液，PBS洗滌2次，熒光倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.7蛋白免疫印跡(Western blot)技術(shù)檢測細胞凋亡信號通路

蛋白樣品制備，收集Bel-7402細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，6孔板中每孔接種約2×105個細胞，置于培養(yǎng)箱中過夜。換液，加入不同濃度Ru-HMIP孵育24 h，收集細胞，按試劑盒步驟提取蛋白(其中細胞色素C的分析提取是細胞質(zhì)蛋白，其他蛋白分析提取的為總細胞蛋白)。測量提取蛋白濃度，將各組蛋白濃度用提取液調(diào)至相同。取適量的蛋白樣品，加入上樣緩沖液稀釋，100 ℃加熱5 min使蛋白變性，20 000 r/min離心，取上清待用。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)到PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出膜用TBST沖洗一遍，浸沒于封閉液封閉1 h。把膜從封閉液里取出，用TBST沖洗一遍后，浸沒于一抗里，置于4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3次，每次6 min。加入相應二抗室溫搖床孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST洗膜3遍，每次5 min。然后將ECL均勻滴加到PVDF膜，覆蓋上保鮮膜，置于曝光盒內(nèi)后曝光顯影。根據(jù)目的蛋白信號強弱選擇曝光時間以獲得最佳效果，掃描膠片，保存分析結(jié)果。

2結(jié)果

2.1Ru-HMIP對Bel-7402細胞的抑制作用

體外實驗顯示(表1)，不同實驗濃度的Ru-HMIP均能夠有效殺傷Bel-7402肝癌細胞，且隨著劑量的增大抑制率增高，存在劑量-效應關(guān)系，其半數(shù)抑制濃度為6.98 μmol/L，95%可信區(qū)間為5.97～8.17 μmol/L。

2.2Ru-HMIP對Bel-7402細胞凋亡的影響

劑量為5 μmol/L的Ru-HMIP作用Bel-7402細胞24 h后，檢測到9.4%的細胞發(fā)生早期凋亡，11.6%發(fā)生晚期凋亡；作用濃度為10 μmol/L時，34.3%的細胞處于早期凋亡狀態(tài)，19.7%的細胞處于晚期凋亡狀態(tài)。當作用濃度提高到20 μmol/L時，共有71%的細胞處于凋亡狀態(tài)(圖1)。

表1Ru-HMIP作用24 h 后對Bel-7402細胞增殖的影響

Table 1Effect of Ru-HMIP on Bel-7402 cell proliferation

組別劑量/(μmol·L-1)抑制率/%IC50/(μmol·L-1)對照組-00.1%DMSO-2.21±0.65Ru-HIMP2.520.56±3.466.98545.23±4.661056.34±4.6595%可信區(qū)間=2082.38±5.47(5.97～8.17)4092.13±6.65

2.3Ru-HMIP對Bel-7402細胞內(nèi)ROS水平及其對細胞毒性的影響

Ru-HMIP作用于Bel-7402細胞12 h后，可以產(chǎn)生劑量依賴的ROS，其水平與陽性對照H2O2相當。同時，NAC可以完全抑制Ru-HMIP或者H2O2在Bel-7402細胞中誘發(fā)的ROS(圖 2A)。進一步研究了Ru-HMIP產(chǎn)生的ROS與其細胞毒性的相關(guān)性，結(jié)果顯示，在將Bel-7402細胞預先用NAC處理之后，可以明顯降低H2O2或者Ru-HMIP對Bel-7402產(chǎn)生的細胞毒性(圖 2B)。

2.4Ru-HMIP對Bel-7402細胞線粒體膜電位影響

熒光倒置顯微鏡檢測細胞線粒體膜電位結(jié)果顯示(圖3)，Ru-HMIP作用Bel-7402細胞12 h后，由于其線粒體去極化導致線粒體膜電位的下降，JC-1在線粒體基質(zhì)中形成的聚集體減少，導致在給藥組細胞內(nèi)的綠色熒光增強，相對于對照組的熒光曲線截面發(fā)生偏移。隨著Ru-HMIP濃度的增加，細胞內(nèi)綠色熒光強度逐漸增加，說明Ru-HMIP的確引起了Bel-7402細胞線粒體膜電位的下降。

2.5Ru-HMIP對Bel-7402細胞凋亡通路的影響

Ru-HMIP作用于Bel-7402細胞24 h后，細胞中非活化的Caspase-9含量降低，而活化型Caspase-9含量增加，且呈現(xiàn)良好的劑量-效應關(guān)系。相應地，細胞中非活化的Caspase-3表達量降低，活化的Caspase-3表達量上調(diào)。同時，Ru-HMIP作用于Bel-7402后，細胞質(zhì)中細胞色素C的含量明顯升高。另外，另一組重要的與凋亡相關(guān)的Bcl蛋白家族分子檢測結(jié)果顯示，Ru-HMIP明顯抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，并增加了促凋亡蛋白Bax的表達水平。見圖4。

PI-A10510410310201051041031020AnnexinV-FITCABCD01021031041050102103104105

A. 空白對照細胞； B. Ru-HMIP(5 μmol/L)處理24 h；

C. Ru-HMIP(10 μmol/L)處理24 h； D. Ru-HMIP(20 μmol/L)處理24 h。Q3.存活細胞； Q4.早期凋亡細胞； Q2.晚期凋亡細胞。

圖1Annexin V-FITC/PI雙染檢測Ru-HMIP誘導Bel-7402細胞凋亡

Figure 1Apoptosis of Bel-7402 cells induced by Ru-HMIP detected by annexinV-FITC/PI assay

121086420140120100806040200AB相對熒光強度相對細胞存活率/%h1O2h1O2+NAC(10mmol?L-1)Ru-HMIPRu-HMIP+NAC(10mmol?L-1)h1O2h1O2+NAC(10mmol?L-1)Ru-HMIPRu-HMIP+NAC(10mmol?L-1)h1O2Ru-HMIP0200400600800100002.55102040c/(μmol?L-1)

A. Ru-HMIP或者H2O2作用于Bel-7402細胞后ROS水平及NAC對其影響； B. Ru-HMIP或者H2O2對Bel-7402的細胞毒性以及NAC對其影響。

圖2Ru-HMIP誘發(fā)Bel-7402細胞內(nèi)ROS及其細胞毒性

Figure 2ROS and cytotoxicity on Bel-7402 cells induced by Ru-HMIP

A.空白對照細胞； B. Ru-HMIP(5 μmol/L)處理12 h； C. Ru-HMIP(10 μmol/L)處理12 h； D. Ru-HMIP(20 μmol/L)處理12 h。

圖3Ru-HMIP對Bel-7402細胞線粒體膜電位作用 (JC-1染色，200×)

Figure 3Effect of Ru-HMIP on mitochondrial membrane potential of Bel-7402 cells(JC-1,200×)

Bcl-2BaxCaspase-9C-Caspase-9Caspase-3C-Caspase-3Cyto-Cβ-actin1234

1. Con; 2. 5 μmol/L Ru-HMIP; 3. 10 μmol/L Ru-HMIP;

4. 20 μmol/L Ru-HMIP。

圖4不同配合物濃度作用細胞凋亡通路相關(guān)蛋白WB結(jié)果Figure 4Effect of Ru-HMIP at different concentrations on the expression of cell apoptotic proteins

3討論

線粒體中的一系列代謝過程與細胞發(fā)生凋亡密切相關(guān)，一些外源性化合物可以誘導呼吸鏈中ROS的過度生成，通過內(nèi)源性線粒體凋亡通路誘導細胞發(fā)生凋亡[9]。本研究顯示，Ru-HMIP可以在Bel-7402細胞中誘導產(chǎn)生大量ROS，繼而導致線粒體的內(nèi)外膜間膜電位崩坍，期間伴隨著Bax表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)(圖4)。Bcl-2家族成員是線粒體通透性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者。其中抗凋亡蛋白Bcl-2可以抑制線粒體的通透性，阻滯細胞色素C從線粒體釋放，Bax可以與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，是促凋亡蛋白。此消彼長導致線粒體內(nèi)膜非特異性孔道產(chǎn)生，導致線粒體膨大，細胞色素C從內(nèi)膜脫落并流失到胞漿中，激活了相應的Caspase蛋白(圖4)。Caspase蛋白家族是細胞凋亡通路重要的蛋白因子，其中Caspase-9活化剪切Caspase-3是線粒體凋亡通路中重要環(huán)節(jié)[10]。Ru-HMIP作用于Bel-7402后，細胞中非活化的Caspase-9含量降低，而活化型Caspase-9增多。相應地，細胞中非活化的Caspase-3含量下調(diào)，活化的Caspase-3上調(diào)，而Caspase-3的激活被認為是細胞發(fā)生不可逆凋亡的標志。

綜上所述，Ru-HMIP能夠有效誘導肝癌細胞Bel-7402發(fā)生凋亡，其作用機制是在細胞內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，導致線粒體膜電位下降，繼而影響B(tài)cl-2蛋白家族表達量的變化，引起線粒體膜通透性的增強，細胞色素C滲漏到細胞漿中，最后激活了Caspases家族，最終導致細胞發(fā)生凋亡。

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(責任編輯：幸建華)

Mechanism of novel ruthenium complex on induction of intrinsic mitochondria-mediated apoptosis in Bel-7402 cells

WANG Jinquan,BO Huaben,CHEN Qizhu

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To study the cytotoxicity and its mechanism of ruthenium complex Ru-HMIP on liver cancer Bel-7402 cells. Methods MTT assay was employed to determine the cytotoxicity of Ru-HMIP. The apoptosis was detected by flow cytometry. The mitochondrial membrane potential was determined by JC-1 probe and the formation of intracellular ROS was measured by DCFH-DA probe. Western blot was performed to study the apoptosis pathway. Results Ru-HMIP inhibited effectively the growth of Bel-7402 cells by induction of cell apoptosis. Ru-HMIP enhanced the production of ROS in Bel-7402 cells,which could be inhibited by NAC. In addition,the cytotoxicity of Ru-HMIP was prohibited by NAC. After treated by Ru-HMIP,the collapse of the mitochondrial membrane potential was found. Meanwhile,the upregulation of Bax,down-regulation of Bcl-2,and activation of Caspase-9 and Caspase-3 were observed. Conclusion Ru-HMIP inhibits the growth of Bel-7402 cells in vitro. The mechanism of Ru-HMIP cytotoxicity is attributed to excess ROS induction in Bel-7402 cells,which destroys the mitochondrial membrane potential and triggers intrinsic mitochondria-mediated apoptosis.

Key words:ruthenium complex; Bel-7402 cells; ROS; apoptosis pathway

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2016011702

中圖分類號:R730.2

文獻標志碼:A

文章編號:1006-8783(2016)02-0238-03

作者簡介：王金全(1979—)，男，博士，講師，主要從事抗腫瘤藥物研究，Email：solo_wjq@126.com。

基金項目：國家自然科學基金項目(81403317)；廣東省科技計劃項目(2015A020211037)

收稿日期：2016-01-17

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2016-04-11 17:03網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160411.1703.005.html