曾昭智，張錦紅，陸少君

(廣東藥科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006)

?

胎盤生長(zhǎng)因子抗體對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的治療作用

曾昭智，張錦紅，陸少君

(廣東藥科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州 510006)

摘要:目的 探討胎盤生長(zhǎng)因子抗體(anti-PLGF)對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的治療作用。方法 自體移植法建立大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型，分別觀察anti-PLGF對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型異位子宮內(nèi)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)、腹腔液血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白細(xì)胞介素-8的影響。結(jié)果 anti-PLGF 1 mg/kg劑量組能明顯抑制模型大鼠腹腔液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，并能顯著減小大鼠子宮內(nèi)膜異位組織的體積，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而腹腔液中白細(xì)胞介素-8水平無明顯變化。結(jié)論 anti-PLGF通過抑制異位內(nèi)膜的血管形成，從而有效抑制異位內(nèi)膜的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞:胎盤生長(zhǎng)因子抗體； 子宮內(nèi)膜異位癥； 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子； 白細(xì)胞介素-8

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是育齡婦女的常見疾病。臨床主要表現(xiàn)有痛經(jīng)、盆腔包塊或觸痛的結(jié)節(jié)、不孕、月經(jīng)不調(diào)等，具有侵襲性、廣泛種植、易復(fù)發(fā)的特性，有類似于惡性腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和種植生長(zhǎng)的能力，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液及子宮內(nèi)膜等局部組織中胎盤生長(zhǎng)因子(placental growth factor，PLGF)水平明顯升高[1-3]，PLGF是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular epithelial growth factor，VEGF)家族成員，PLGF與受體結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用，可增加VEGF活性及誘導(dǎo)血管生成。白細(xì)胞介素-8(IL-8)細(xì)胞因子同樣具有強(qiáng)生血管活性，能促進(jìn)新生血管的形成，使異位內(nèi)膜基底部毛細(xì)血管的數(shù)量和面積均顯著增多[4]。2007年Fischer等[5]的研究證明，胎盤生長(zhǎng)因子抗體(anti-PLGF)可以抑制腫瘤組織的血管生成，而對(duì)正常的血管沒有影響。本實(shí)驗(yàn)從抑制血管生成的角度探討anti-PLGF對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的治療作用及其機(jī)制。

1材料

1.1藥物與試劑

anti-PLGF(上海瑞齊生物技術(shù)有限公司)；白細(xì)胞介素和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子ELISA檢測(cè)試劑盒(上海哈靈生物科技有限公司)；沙利度胺(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；磷酸鹽緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2主要儀器

FA2004B電子天平(上海精科天美)；BA310顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司)；3K15冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA)；Infinite 200 pro酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠，雌性，體質(zhì)量180～220 g，南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2011-0015。

2方法

2.1大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型建立

參照文獻(xiàn)[6]，取雌性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，各鼠以40 mg/kg戊巴比妥腹腔注射麻醉，在大鼠下腹部正中靠左上方做一個(gè)1.5 cm切口，挑出左側(cè)子宮角，結(jié)扎子宮系膜血管，再結(jié)扎需切除的子宮段的兩端，切取一段1.5 cm長(zhǎng)的子宮。在無菌的戴克隆氏液中分離子宮內(nèi)膜，然后切取5 mm×5 mm的內(nèi)膜組織片段，將上皮層對(duì)著腹壁，縫合于腹壁上。建模后3周，擇動(dòng)情期大鼠，開腹見移植子宮內(nèi)膜體積增大，形成內(nèi)有液體積聚并有血管形成的透明小囊泡，以體積≥20 mm3，內(nèi)膜囊泡可見透明積液為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

2.2分組及給藥

取建模成功40只大鼠，按異位內(nèi)膜體積大小隨機(jī)分為4組，即模型組、沙利度胺陽(yáng)性藥物組、anti-PLGF高、低劑量組，另取同批正常10只大鼠作為正常對(duì)照，各組每天腹腔注射1次，陽(yáng)性藥物組注射沙利度胺50 mg/kg，anti-PLGF高、低劑量組分別注射anti-PLGF 1 mg/kg、0.5 mg/kg，正常組和模型組注射等體積的生理鹽水，連續(xù)2周。

2.3觀察指標(biāo)

2.3.1大鼠異位內(nèi)膜體積測(cè)量除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物用游標(biāo)卡尺測(cè)量異位子宮內(nèi)膜病灶的長(zhǎng)、寬和高，并計(jì)算體積(V)，V=長(zhǎng)mm×寬mm×高mm。

2.3.2腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子的含量測(cè)定末次注射24 h后，乙醚麻醉大鼠，腹腔注射磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL，輕揉腹部，打開腹腔，沿腹壁吸取約5 mL 腹腔液，4 ℃，2 000 r/min離心15 min，取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?，腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子含量的測(cè)定按照ELISA試劑盒說明書操作。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3結(jié)果

3.1anti-PLGF對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜移植物體積和大致形態(tài)的影響

肉眼觀察除正常對(duì)照組外，各組大鼠均在右側(cè)腹壁見有異位病灶。模型組大鼠異位內(nèi)膜生長(zhǎng)良好，體積明顯增大，呈隆起透亮的小囊狀，內(nèi)部充滿積液，表面血管清晰可見，而給藥組體積明顯較模型組縮小，周圍血管形成沒有模型組豐富。從表1可以看出，與模型組比較，沙利度胺組、anti-PLGF高劑量組動(dòng)物的內(nèi)膜移植物體積明顯變小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示anti-PLGF有抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠移植物體積的作用。

表1anti-PLGF對(duì)大鼠子宮內(nèi)膜移植物體積的影響

組別劑量/(mg·kg-1)給藥前體積/mm3給藥后體積/mm3模型組-88.47±11.4389.86±10.87沙利度胺組5089.51±10.8841.59±3.63*anti-PLGF 高劑量組192.83±9.6652.47±6.52* 低劑量組0.591.12±11.2884.19±7.85

與模型組比較：*P<0.05。

3.2anti-PLGF對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子含量的影響

模型組大鼠腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子水平明顯高于正常對(duì)照組，而anti-PLGF和沙利度胺治療14 d 后，腹腔液中VEGF水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，anti-PLGF對(duì)IL-8細(xì)胞因子水平無明顯影響，結(jié)果見表2。

表2anti-PLGF對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子含量的影響

組別劑量/(mg·kg-1)w(VEGF)/(ng·kg-1)ρ(IL-8)/(ng·L-1)正常對(duì)照組-3.27±0.76*14.22±2.46*模型組18.58±3.2144.00±8.85沙利度胺組507.15±1.24*20.23±5.87*anti-PLGF 高劑量組114.15±1.10*40.39±6.53 低劑量組0.517.25±2.3040.68±7.00

與模型組比較：*P<0.05。

4討論

在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展過程中，新生血管可以為異位病灶提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此血管生成是異位病灶種植和增殖的必要條件[7]，相關(guān)研究已證實(shí)，子宮內(nèi)膜異位癥異位病灶及腹腔液中存在多種血管生長(zhǎng)因子且水平較正常明顯升高，其中包括VEGF和IL-8細(xì)胞因子，其均能促進(jìn)血管生成。PLGF是VEGF家族成員之一，PLGF與受體結(jié)合后可增加VEGF的活性，促進(jìn)血管生成，PLGF在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病過程中有一定作用，anti-PLGF或其受體抗體制劑等抑制血管生成的藥物治療可能會(huì)為子宮內(nèi)膜異位癥的治療開辟一條新的途徑[8]。本實(shí)驗(yàn)用anti-PLGF作為藥物觀察其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠的治療作用，結(jié)果顯示：anti-PLGF和沙利度胺能有效縮小大鼠內(nèi)膜移植物體積，減少異位病灶周圍血管形成，模型組中大鼠腹腔液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子水平明顯高于正常對(duì)照組，anti-PLGF和沙利度胺治療后能降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中VEGF水平，使異位內(nèi)膜的增殖速度降低，從而減少血管生成，降低血供，抑制異位內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)。但anti-PLGF對(duì)腹腔液中IL-8細(xì)胞因子水平無明顯影響。因此，anti-PLGF通過調(diào)節(jié)VEGF生成，抑制異位內(nèi)膜組織的生長(zhǎng)發(fā)育，達(dá)到治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用，但其對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠組織及血液中VEGF和IL-8細(xì)胞因子水平的影響還不清楚，尚需進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn):

[1] SUZNMORI N,SUGIURA-OGASAWARA M,KATANO K,et a1.Woman with endometriosis have increased levels of placental growth factor in the peritoneal fluid compared with women with cystodenomas[J]. Hum Reprod,2003,18(12):2595-2598.

[2] ADINI A,KOMAGA T,FIROOZBAKHT F,et a1.Placental growth factor for tumor endothelial cells and macrophages[J]. Cancer Res,2002,62(10):2749-2752.

[3] OURA H,BERTONCINI J,VELASCO P,et a1. A critical role of placental groth factor in the induction of inflammation and edema formation[J]. Blood,2003,101(2):560-567.

[4] 郭永紅,李光榮.丹赤膠囊對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠腹腔液中IL-8和TNF-α水平的影響[J]. 天津中醫(yī)藥,2009,26(5):417-419.

[5] FISCHER C，JONCKX B，MAZZONE M，et a1. Anti-PLGF inhibits growth of vegf(r)-inhibitor-resistant tumors without affecting healthy vessels[J]. Cell，2007，131(3)：463-475.

[6]江濤,楊超燕,唐春萍.奇丹顆粒治療子宮內(nèi)膜異位癥的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中成藥,2009,31(7):1017-1020.

[7] TAYLOR H S,OSTEEN K G,BRUNER-TRAN K L,et al. Novel therapies targeting endometriosis[J]. Reprod Sci,2011,18(9): 814.

[8] 王竹輝,何福仙.胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF)及其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(VEGFR-1)在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)及意義[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2006,14(10):16-18.

(責(zé)任編輯：幸建華)

Effect of anti-placenta growth factor antibody on endometriosis in rats

ZENG Zhaozhi,ZHANG Jinhong,LU Shaojun

(DepartmentofLaboratoryAnimalCenter,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To explore the effect of anti-placenta growth factor (PLGF) antibody on endometriosis in rats. Methods The endometriosis model was established by autologous transplantation of endometrial tissue in rats. The effect of anti-PLGF antibody on the production of peritoneal VEGF and IL-8 and endometrium morphosis in endometriosis rats were detected. Results Compared with the model group,treatment with anti-PLGF antibody (1 mg/kg) reduced the level of VEGF and the volume of endometriosis tissue in rats (P<0.05). But the level of IL-8 did not show a significant difference in both groups. Conclusion Treatment with anti-PLGF antibody can inhibit the vasifaction and growth of ectopic endometrium in rats.

Key words:anti-placenta growth factor (PLGF) antibody; endometriosis; VEGF; IL-8

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2016030201

中圖分類號(hào):R965

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1006-8783(2016)02-0228-03

作者簡(jiǎn)介：曾昭智(1980—)，男，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究，Email: 2000zzz@163.com。

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2013191)

收稿日期：2016-03-02

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-28 15:52網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160328.1552.001.html