梁悅怡，謝守軍

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

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FLAER多參數(shù)檢測(cè)PNH克隆的意義

梁悅怡，謝守軍△

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000)

摘要:目的探討熒光標(biāo)記的嗜水氣單胞菌溶素變異體(FLAER)、CD45、CD15、CD24多參數(shù)檢測(cè)粒細(xì)胞PNH克隆對(duì)于疾病診斷和鑒別診斷的意義，并與CD59檢測(cè)進(jìn)行比較。方法應(yīng)用流式細(xì)胞儀分別檢測(cè)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)、再生障礙性貧血(AA)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和正常人粒細(xì)胞FLAER和紅細(xì)胞CD59的缺失率。結(jié)果與AA、MDS及正常組相比，PNH患者外周血CD59、FLAER缺失率均明顯增高(P<0.05)；在PNH組中，F(xiàn)LAER缺失率顯著高于CD59缺失率(P<0.05)；在AA和MDS組中，個(gè)別CD59缺失率為0的患者，檢測(cè)出FLAER的缺失。結(jié)論FLAER檢測(cè)較CD59相比靈敏性和特異性更高，對(duì)微小PNH克隆更敏感，對(duì)PNH、MDS和AA的診斷鑒別具有一定的意義。

關(guān)鍵詞:陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥；流式細(xì)胞術(shù)；熒光標(biāo)記的嗜水氣單胞菌溶素變異體

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(PNH)是一種獲得性克隆性造血干細(xì)胞疾病，其發(fā)病機(jī)制主要是由于體細(xì)胞X染色體上的PIG-A基因突變，導(dǎo)致血細(xì)胞膜表面糖化磷脂酰肌醇(GPI)錨合成障礙，錨連接蛋白缺失[1]。傳統(tǒng)的診斷方法主要有蔗糖溶血試驗(yàn)、酸溶血試驗(yàn)、尿含鐵血黃素試驗(yàn)，但這些方法敏感性、特異性差[2]。近些年來，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD55、CD59已經(jīng)成為診斷PNH的常規(guī)方法，特別是CD59，其敏感性高于CD55，在PNH診斷過程中被認(rèn)為是一個(gè)優(yōu)于CD55的指標(biāo)[3]。熒光標(biāo)記的無活性嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體(FLAER)可以特異性的與GPI錨連蛋白結(jié)合，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，其特異性和敏感性較傳統(tǒng)方法更好。PNH、再生障礙性貧血(AA)和骨髓增生異常綜合征(MDS)均為骨髓衰竭性疾病，具有相似的發(fā)病機(jī)制和臨床表現(xiàn)，早期鑒別診斷常很困難。本文聯(lián)合FLAER、CD45、CD15、CD24多參數(shù)檢測(cè)粒細(xì)胞PNH克隆以及CD59檢測(cè)紅細(xì)胞PNH克隆，旨在有效提高PNH克隆檢測(cè)的敏感性、特異性，有助于骨髓衰竭性疾病的早期鑒別診斷，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料所有病例均來自于本院血液科連續(xù)48例住院患者。其中PNH患者9例，AA患者13例，診斷均符合血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[4]；MDS患者11例，符合2008年WHO診斷分型標(biāo)準(zhǔn)[5]。對(duì)照組15例均為巨幼細(xì)胞性貧血患者。

1.2儀器與試劑FACSAria型流式細(xì)胞儀，溶血素、磷酸鹽緩沖液(PBS)和CD59、CD45、CD15、CD24試劑和均購自BD公司，F(xiàn)LAER試劑購自加拿大Protox Biotech公司。

1.3方法

1.3.1外周血紅細(xì)胞CD59檢測(cè)取EDTA抗凝全血100 μL，經(jīng)PBS洗滌后稀釋于1.5 mL的PBS中，取100 μL加入CD59-PE單抗20 μL，4 ℃避光孵育30 min后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL PBS液洗滌2遍，重懸于1 mL PBS液中上機(jī)檢測(cè)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定CD59細(xì)胞的表達(dá)率。

1.3.2外周血粒細(xì)胞FLAER檢測(cè)取EDTA抗凝全血100 μL，加入CD45、CD15、CD24、FlAER抗體各20 μL,避光孵育30 min后，加入2 mL溶血素，室溫下避光10 min，溶血完全后1 000 r/min離心5 min，棄上清，用2 mL PBS液洗滌2遍，重新懸于500 μL的PBS液中液上機(jī)檢測(cè)，用流式細(xì)胞儀測(cè)定FLAER的表達(dá)率。

2結(jié)果

2.1臨床特征PNH患者9例，男6例、女3例，年齡16～60歲，中位年齡30歲；AA患者13例，男5例、女8例，年齡7～63歲，中位年齡38；MDS患者11例，男5例、女6例，年齡41～72歲，中位年齡53歲，其中RCMD 1例，RCUD 6例，RAEB-Ⅰ2例RAEB-Ⅱ1例，5q-綜合征1例；對(duì)照組15例，男6例、女9例，年齡19～61歲，中位年齡34歲。

2.2不同方法對(duì)PNH患者檢測(cè)的比較PNH組患者FLAER缺失率和CD59缺失率分別為(70.07±28.77)%和(38.51±29.15)%,顯著高于對(duì)照組、AA組、MDS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。FLAER檢測(cè)結(jié)果明顯高于CD59檢測(cè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，有2例患者，一例CD59缺失率為7.8%，F(xiàn)LAER缺失率為88.1%；另一例CD59缺失率為5.5%，F(xiàn)LAER缺失率為23.2%，見圖1。

2.3不同方法對(duì)非PNH患者檢測(cè)的比較各組中FLAER缺失率平均值均大于CD59缺失率，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1，表明在非PNH組中FLAER和CD59檢測(cè)無顯著差異。對(duì)照組中FLAER缺失率為0.0%，特異性100%，有3例存在CD59缺失，缺失率均小于1%。13例AA患者中5例檢測(cè)出FLAER缺失，其中4例檢測(cè)出CD59缺失，1例未檢測(cè)出，見圖2；11例MDS患者中3例檢測(cè)出FLAER缺失，其中2例存在CD59缺失，1例CD59缺失率為0，見表2。結(jié)果說明FLAER檢測(cè)比CD59檢測(cè)更為敏感，特異性更好。

A：PNH患者FLAER缺失率為5.5%；B：PNH患者CD59缺失率為23.2%。

圖1　　PNH患者FLAERD59和CD59的缺失率

表2　　PNH陽性MDS和AA患者FLAER和

A：AA患者FLAERD59缺失率為4.2%；B：AA患者CD59缺失率為0%。

圖2AA患者FLAERD59和CD59的缺失率

3討論

到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了20多種蛋白在PNH患者血細(xì)胞表面表達(dá)缺乏，其中紅細(xì)胞膜上衰變加速因子(CD55)和反應(yīng)性溶血膜抑制物(CD59)的缺失被認(rèn)為是引起PNH病理生理的主要原因[6]。紅細(xì)胞數(shù)目多、抗體表達(dá)強(qiáng)是靈敏度檢測(cè)最好的目標(biāo)細(xì)胞。尤其是在一些粒細(xì)胞減少的疾病中如AA、MDS，紅細(xì)胞檢測(cè)尤為重要。同時(shí)，通過比較紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)值，可以給臨床提供更多信息[7]。CD55分子在紅細(xì)胞上表達(dá)較低，而CD59分子的熒光染色強(qiáng)且均一，近些年來已成為PNH診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”。然而，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)檢測(cè)紅細(xì)胞CD59表達(dá)對(duì)PNH的診斷有一定的局限性。本研究發(fā)現(xiàn)，在PNH組的兩例患者中，一例CD59缺失率為5.5%，另一例CD59缺失率為2.9%，而FLAER缺失率分別為23.2%和47.7%?？赡苁怯捎诨颊哒幱诩膊〉幕顒?dòng)期，接受輸血治療，影響了紅細(xì)胞CD59的表達(dá)，導(dǎo)致CD59表達(dá)出現(xiàn)假陽性。有研究表明，在小細(xì)胞低色素性貧血時(shí)，病人的紅細(xì)胞膜表面的CD59表達(dá)均有降低，但粒細(xì)胞是正常的，若只檢測(cè)紅細(xì)胞的CD59會(huì)造成其表達(dá)假陰性[8]。此外，正常細(xì)胞衰老時(shí)表面分子CD59還有可能自發(fā)丟失，均可導(dǎo)致檢測(cè)值偏離事實(shí)[9]。隨著技術(shù)不斷進(jìn)步，人們研究出了FLAER技術(shù)，F(xiàn)LAER是Alexa-488標(biāo)記的無活性的嗜水氣單胞菌溶素前體的變異體，可以特異性地與GPI錨鏈蛋白結(jié)合，在所有具有GPI錨連蛋白的粒細(xì)胞上均有特異性表達(dá)，不會(huì)因不同細(xì)胞表達(dá)GPI錨鏈蛋白的多少和種類不同造成誤差。由于FLAER能直接檢測(cè)GPI蛋白，有助于識(shí)別真正的PNH和免疫性血細(xì)胞減少癥，明確真正的GPI陰性細(xì)胞。本研究中對(duì)照組FLAER檢測(cè)缺失率均為0，與CD59相比檢驗(yàn)結(jié)果更具有特異性；在PNH組中，F(xiàn)LAER的缺失率顯著高于CD59，敏感性更高。FLAER也是防止門內(nèi)出現(xiàn)污染細(xì)胞最好的抗體。如果門內(nèi)污染了少量的CD24陰性表達(dá)的細(xì)胞群，可能會(huì)被誤認(rèn)為是小的PNH克隆，而FLAER與CD24一起使用可以提高PNH檢測(cè)的準(zhǔn)確性，CD24/FLAER雙陰性細(xì)胞群才是真正PNH克隆細(xì)胞群。FLAER多參數(shù)檢測(cè)要求外周血標(biāo)本采集后必需及時(shí)送檢，否則會(huì)導(dǎo)致粒細(xì)胞存活率下降，細(xì)胞非特異性染色增強(qiáng)，影響檢測(cè)效果。這在一定程度上影響了FLAER在臨床上的應(yīng)用。PNH克隆的檢出對(duì)于MDS和AA的臨床表現(xiàn)、治療及轉(zhuǎn)歸有重要意義。部分具有PNH克隆的AA患者對(duì)免疫治療效果更好，即使小于0.1%的克隆也會(huì)影響治療效果[7]。對(duì)于檢測(cè)出少量PNH克隆的AA患者，需監(jiān)測(cè)PNH克隆數(shù)的變化，因?yàn)榛颊哂锌赡馨l(fā)展為溶血性貧血。在本研究中，PNH與MDS的關(guān)系只局限在低危MDS中,表現(xiàn)為血細(xì)胞減少，骨髓增生低下；遺傳學(xué)異常發(fā)生率低，臨床過程惰性進(jìn)展，更多地表現(xiàn)為骨髓衰竭的特點(diǎn)。AA組、MDS組中FLAER的缺失率均大于CD59的缺失率。由于AA和低增生性MDS的鑒別十分困難，但到目前為止還沒有報(bào)道MDS的患者進(jìn)展為PNH，監(jiān)測(cè)PNH克隆對(duì)于這兩種疾病的鑒別具有一定的意義。AA、MDS患者中檢測(cè)出的PNH克隆常常很小，CD59檢測(cè)不易測(cè)出。在這兩組中各有1例患者CD59缺失率為0，而FLAER表達(dá)均有缺失,缺失率分別為4.2%、2.9%。FLAER檢測(cè)更敏感，與CD59相比靈敏度更高。由于AA、低增生性MDS和PNH均屬于骨髓衰竭性疾病，具有相似的發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)和生物學(xué)特性，三種疾病之間的鑒別很困難。FLAER檢測(cè)與CD59相比靈敏性和特異性更高。能夠早期提供更為靈敏、特異的PNH克隆依據(jù)，在臨床癥狀不典型、診斷不明確的疑似PNH患者，輔以FLAER檢測(cè)有助于早期確診或除外診斷。因此，F(xiàn)LAER高靈敏度檢測(cè)PNH克隆對(duì)這三種疾病及疾病之間的診斷鑒別及了解臨床過程、預(yù)后及轉(zhuǎn)歸具有一定的意義。

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(收稿日期：2016-01-12)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.055

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)08-1139-03

△通訊作者，E-mail：shoujunxie69@163.com。

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