陳　銳，陳艷清，賈　建，許　瑤，張達(dá)秀，李婉葵，邵錦歡

(東莞市塘廈醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523721)

?

·臨床研究·

病毒性心肌炎患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ細(xì)胞因子水平的分析

陳銳，陳艷清，賈建，許瑤，張達(dá)秀，李婉葵，邵錦歡

(東莞市塘廈醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東東莞 523721)

摘要:目的研究病毒性心肌炎患者外周血中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的水平，分析上述指標(biāo)與心肌炎的相關(guān)性。方法選取2013年1月至2015年1月間入院就診的病毒性心肌炎患者32例，作為實(shí)驗(yàn)組。選取同期入院體檢的健康人32例作為對照組。應(yīng)用ELISA方法檢測血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平。32例病毒性心肌炎患者應(yīng)用常規(guī)抗病毒、鎮(zhèn)靜治療后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平，觀察并比較治療前后3項(xiàng)指標(biāo)的變化。結(jié)果病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢復(fù)期稍有下降，當(dāng)仍顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明顯較高(P<0.05)。結(jié)論血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平變化在病毒性心肌炎發(fā)病中有重要作用，可在臨床作為病情判斷及療效評價(jià)的參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:病毒性心肌炎；腫瘤壞死因子-α；轉(zhuǎn)化生長因子-β1；細(xì)胞因子干擾素-γ

病毒性心肌炎(viral myocardtis，VMC)指病毒感染心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞溶解引起心肌局限性或彌漫性的急性或慢性炎癥病變，結(jié)果造成病毒對心肌細(xì)胞直接損傷和繼發(fā)免疫反應(yīng)對心肌組織的持續(xù)損害[1]。目前臨床尚未能確認(rèn)VMC確切的發(fā)病機(jī)制，但機(jī)體免疫功能紊亂和炎性細(xì)胞因子在其發(fā)病中的作用不容小覷。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激合成、分泌的一類具有廣泛生物學(xué)活性的小分子蛋白質(zhì)，通過結(jié)合相應(yīng)受體從而具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用。本研究就VMC患者外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ 細(xì)胞因子的水平進(jìn)行了分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選取2013年1月至2015年1月間入院就診的病毒性心肌炎患者32例，作為實(shí)驗(yàn)組。所有患者均符合成年人急性病毒性心肌炎的診斷參考標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。選取同期入院體檢的健康人32例作為對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：先天性心臟病、心肌病等心臟疾?。?個(gè)月內(nèi)無感染、腹瀉病史；智力及精神異常，無法配合此次研究者。實(shí)驗(yàn)組32例患者中，男19例、女13例；年齡30～65歲，平均(46.25±12.03)歲；發(fā)病前1～3周均有上呼吸道感染史。對照組32例中男18例、女14例；年齡32～61歲，平均(46.32±11.91)歲。兩組在年齡、性別等基礎(chǔ)資料方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可參與比較。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集所有受試者在清晨空腹抽取靜脈血3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上層血清，分裝-20 ℃留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2標(biāo)本的檢測應(yīng)用ELISA檢測兩組患者血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白含量，試劑盒購自bd biosciences pharmingen公司。操作步驟如下，(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線：凍干標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶，靜置15 min，倍比梯度稀釋(標(biāo)準(zhǔn)曲線取7個(gè)點(diǎn)，最高濃度為1 000 pg/mL,標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液直接加入作為0濃度)。(2)取標(biāo)本血清及標(biāo)準(zhǔn)品100 μL加入相應(yīng)孔中，封板，室溫孵育2 h，洗板5次，拍干。加生物素化抗體100 μL到每孔，封板，室溫孵育1 h，洗5次，拍干。加酶結(jié)合物100 μL，封板，暗室室溫孵育20 min，洗5次，拍干。加顯色劑100 μL，暗室室溫孵育20 min，加終止液100 μL終止反應(yīng)。(3)酶標(biāo)儀檢測，讀其A450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，算出標(biāo)本濃度。并在32例病毒性心肌炎患者應(yīng)用常規(guī)抗病毒、鎮(zhèn)靜治療后，另行蛋白水平檢測。設(shè)定實(shí)驗(yàn)組治療前為VMC急性期，治療后為VMC恢復(fù)期。

同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，見表1，檢測兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平。檢測試劑盒、引物和探針序列均由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司提供，檢測儀器使用羅氏 Lighteyeler 熒光定量PCR 儀。

2結(jié)果

2.1TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平病毒性心肌炎患者急性期TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平水平最高，在恢復(fù)期稍有下降，但仍顯著高于正常對照組(P<0.05)。見表2。

2.2TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平與對照組相比，病毒性心肌炎患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表1　　實(shí)時(shí)熒光定量法檢測TNF-α、TGF-β1和IFN-γ mRNA水平

表2　　兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ蛋白水平

#:與對照組相比，P<0.05；*:與VMC急性期相比，P<0.05。

表3　　兩組患者TNF-α、TGF-β1和IFN-γ

3討論

目前對VMC發(fā)病機(jī)制抑制存在諸多爭議，以免疫學(xué)說與細(xì)胞因子論支持者較多[4]。VMC是由多種病毒引起的以心肌間質(zhì)炎癥為主的疾病，柯薩奇B組病毒是主要病原。病毒通過消化道或呼吸道侵入人體發(fā)生病毒血癥，侵犯心肌。感染初期機(jī)體首先發(fā)動細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對病毒免疫力，同時(shí)單核巨噬細(xì)胞趨化，產(chǎn)生及分泌細(xì)胞因子[5]，進(jìn)而調(diào)控疾病進(jìn)展。

TNF-α是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞吞噬能力、促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化并具有抗感染作用，其既參與機(jī)體免疫系統(tǒng)，也是機(jī)體炎性反應(yīng)及損傷的重要調(diào)節(jié)因子[6]。TNF-α來源廣泛，主要由巨噬細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，心臟既是TNF-α的合成場所又是其作用的靶器官。在本次研究中，TNF-α在VMC急性期表達(dá)高達(dá)(128.31±12.48)ng/L，且TNF-α mRNA水平也顯著高于對照組，提示TNF-α參與了病毒性心肌炎的發(fā)展過程。

TGF-β1是膠原纖維細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積的強(qiáng)有力的始動因子，也是諸多因素導(dǎo)致心肌纖維化最后的共同的中介物之一，研究認(rèn)為TGF-β1陽性表達(dá)是反映心肌炎癥性損傷修復(fù)的靈敏指標(biāo)[7]。本次研究中，VMC急性期患者TGF-β1蛋白水平為(15.18±1.42)ng/mL，VMC恢復(fù)期則為(9.53±1.41)ng/mL，正常對照組僅為(6.27±0.83)ng/mL。汪東華等研究中[8]，TGF-β1在明確心肌炎患者中的表達(dá)水平高達(dá)(32.97±4.88)ng/mL，界限性心肌炎組則為(15.17±1.62)ng/mL，正常對照組TGF-β1水平僅為(6.62±0.98)ng/mL。提示TGF-β1在健康人中水平較低，而病毒性心肌炎病情越重則TGF-β1水平越高。同時(shí)本次研究中TGF-β1水平整體偏低可能與VMC患者病情程度有關(guān)。

IFN-γ是由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的，具有抗病毒的作用，同時(shí)通過參與誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體II類抗原的表達(dá)而發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用[9]。IFN-γ表達(dá)過高會引起自身細(xì)胞的損傷，并可通過影響細(xì)胞表面特定受體而產(chǎn)生負(fù)性肌力作用[10]。同時(shí)IFN-γ可抑制病毒復(fù)制，過低水平的IFN-γ不利于清除病毒。在本次研究中，VMC恢復(fù)期IFN-γ水平介于較高的VMC急性期及較低的對照組之間，證實(shí)了上述理論。

綜上所述，血清中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ水平變化在病毒性心肌炎發(fā)病中有重要作用，可在臨床作為病情判斷及療效評價(jià)的參考指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

[1]張艷，石搏，王元春，等.病毒性心肌炎患兒外周血中TNF-α、TGF-β1和IFN-γ細(xì)胞因子水平分析[J].中國婦幼保健,2013,28(5):789-790.

[2]中華內(nèi)科雜志編委會.全國心肌炎心臟病專題座談會紀(jì)要[J]．中華內(nèi)科雜志，1987，26(35)：597-601．

[3]全國心肌炎.心肌病專題研討會組委會.全國心肌炎、心肌病專題研討會紀(jì)要[J]．臨床心血管病雜志，1995，11(6)：324-326．

[4]Adamopoulos S,Kolokathis F,Gkouziouta A,et al.Cytokine gene polymorphisms are associated with markers of disease severity and prognosis in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J].Cytokine,2011,54(1):68-73.

[5]張小佛，于小華，郭富強(qiáng)，等．病毒性心肌炎患兒血清巨噬細(xì)胞移動抑制因子、腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β表達(dá)及其意義[J]．實(shí)用兒科臨床雜志，2008，23(1)：35-36．

[6]李友邕，周碧燕，覃李線，等．病毒性心肌炎患兒血清中TNF-α、hs-CRP、cTnI檢測的臨床意義[J]．臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(17)：1368-1369．

[7]馬文東，袁媛，楊奕，等.TGF-β1介導(dǎo)的RhoA/ROCK通路在大鼠肺肌成纖維細(xì)胞分化中的調(diào)節(jié)作用[J]．中國病理生理雜志,2013,29(10):1758-1763.

[8]江東華，羅斌，孔小平，等．病毒性心肌炎猝死心肌MMP-9和TGF-β1表達(dá)與心肌纖維化的關(guān)系[J]．中國法醫(yī)學(xué)雜志，2008，23(3)：163-166．

[9]李艷花,張海飛,張鑫辰,等.INF-γ在可溶性β-淀粉樣蛋白(fAβ)介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)毒性中的增敏作用[J]．復(fù)旦學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2013,40(3):259-264.

[10]Balci SO,Col-Araz N,Baspinar O,et al.Cytokine gene polymorphisms in childhood dilated cardiomyopathy:interferon-gamma,tumor necrosis factor-alpha and transforming growth factor-beta 1 genes are associated with the disease in Turkish patients[J].Iran J Pediatr,2013,23(5):603-604.

(收稿日期：2016-01-22)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.08.045

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)08-1119-02