喬　麗, 楊志勇, 許成山， 劉　瑋(中國人民解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科，北京　004； 中國人民解放軍空軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

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光動(dòng)力學(xué)療法對(duì)皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

喬麗1, 楊志勇1, 許成山2， 劉瑋1(1中國人民解放軍空軍總醫(yī)院皮膚科，北京100142；2中國人民解放軍空軍總醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)

摘要：目的探討5-氨基乙酰丙酸-光動(dòng)力學(xué)療法(ALA-PDT)對(duì)體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞增殖及其細(xì)胞周期的影響。方法以體外培養(yǎng)的人皮膚鱗狀細(xì)胞癌A43l細(xì)胞株為研究對(duì)象，一組為對(duì)照組(不處理)，另一組為ALA-PDT組(0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射)，銀染細(xì)胞后鏡下觀察，并計(jì)算核仁組成區(qū)的相對(duì)面積；采用流式細(xì)胞術(shù)分析光動(dòng)力學(xué)治療后各細(xì)胞周期中細(xì)胞分布比例，并計(jì)算增殖指數(shù)。結(jié)果光動(dòng)力學(xué)治療后A43l細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)核仁組成區(qū)的相對(duì)面積顯著降低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明光動(dòng)力學(xué)治療組S期峰低于對(duì)照組，S期細(xì)胞比例顯著降低為(9.2±2.1)%。對(duì)照組和光動(dòng)力學(xué)治療組的增殖指數(shù)分別為(47.0±3.4)%和(31.1±3.1)%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論5-氨基乙酰丙酸-光動(dòng)力學(xué)療法能夠抑制A43l細(xì)胞株的過度增殖，改變其細(xì)胞周期分布。

關(guān)鍵詞：光動(dòng)力學(xué)療法；皮膚鱗狀細(xì)胞癌；增殖指數(shù)；嗜銀蛋白；細(xì)胞周期

鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma)簡(jiǎn)稱鱗癌，是常見的皮膚惡性腫瘤之一，目前其發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚[1]，其危害性大，激光照射、冷凍、電灼等傳統(tǒng)療法不能完全殺死癌細(xì)胞，并且可刺激腫物迅速增生。手術(shù)治療雖可完全清除腫瘤，但會(huì)在顏面等要求美觀的暴露部位留有瘢痕，給接受美容者造成極大痛苦。光動(dòng)力治療是一種微創(chuàng)療法，應(yīng)用ALA-PDT治療癌前病變及皮膚腫瘤的方法在歐美已有較深入的研究與應(yīng)用，但由于人種等原因國內(nèi)該方面的臨床應(yīng)用和研究甚少。細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期及核仁組成區(qū)相關(guān)嗜銀蛋白(argyrophilic protein in nucleolar organizer regions，AgNORs)的表達(dá)關(guān)系密切[2]。本研究采用5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)對(duì)A431細(xì)胞進(jìn)行光動(dòng)力學(xué)療法(photodynamic therapy，PDT)，通過銀染法檢測(cè)A431細(xì)胞中AgNORs的表達(dá)，并通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期的變化，以了解PDT對(duì)A431細(xì)胞的影響。

1材料和方法

1.1主要試劑和儀器

試劑5-ALA購于Sigma公司；熒光染料碘化丙啶購于北京德廣興生物科技有限公司；630 nm半導(dǎo)體紅光激光器(桂林興達(dá)光電醫(yī)療器械有限公司)；LM-93Ⅱ型激光功率計(jì)(中國計(jì)量院)；Olympus-BH2型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

A431細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室保藏)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用0.25%胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液。按1∶2比例傳代，建立病理性A431細(xì)胞的傳代細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)用第4-6代細(xì)胞，待細(xì)胞70%-80%融合時(shí)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)和細(xì)胞爬片染色。

1.3PDT處理和實(shí)驗(yàn)分組

將培養(yǎng)的A431分為對(duì)照組和PDT組，PDT組的A431細(xì)胞與0.4 mg/ml的ALA避光孵育3 h后行激光照射(波長(zhǎng)630 nm，功率密度10 mW/cm2，能量密度2.5 J/cm2)，照射前后均監(jiān)測(cè)輸出功率，輸出功率波動(dòng)范圍<±5%；PDT后繼續(xù)將細(xì)胞放回孵箱中孵育20 h，再進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。對(duì)照組不給予光敏劑和激光照射處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.4AgNORs檢測(cè)方法

AgNORs染色將細(xì)胞爬片低滲處理后，加入固定液室溫固定20 min；按要求分別滴加A、B染液，混勻，加蓋玻片，4 min后待染液變?yōu)樯铧S色，取出凈水沖洗，自然晾干；染色的細(xì)胞爬片置于圖像分析系統(tǒng)的高倍顯微鏡下，S形移動(dòng)玻片，計(jì)數(shù)60個(gè)A431細(xì)胞核仁銀染面積與細(xì)胞核銀染面積灰度比值。

1.5細(xì)胞增殖周期檢測(cè)

采用熒光染料碘化丙啶一步法染色。細(xì)胞處理后消化，PBS洗2次，70%乙醇固定，制成單細(xì)胞懸液106/ml，存4 ℃冰箱。上機(jī)前0.5 h加碘化丙啶(Sigma)DNA染色。用流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA分析，經(jīng)熒光光通量積分后得到DNA含量分布曲線，后通過Modfit 3.0軟件進(jìn)行細(xì)胞周期時(shí)相分析，統(tǒng)計(jì)增殖指數(shù)(proliferation index，PI)，表示對(duì)A431細(xì)胞增殖的影響，其計(jì)算公式如下：PI=[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.15-ALA-PDT對(duì)A431細(xì)胞中AgNORs的影響

在所有A431細(xì)胞核內(nèi)都可明顯見到AgNORs顆粒，呈棕褐色至深黑色，圓形或形狀不規(guī)則，有的周圍有空暈，界限清楚，散在分布，常位于細(xì)胞核中央或偏位。對(duì)照組A431細(xì)胞核內(nèi)核仁濃染、染色質(zhì)增多增粗、分布不均勻，可明顯見到銀染顆粒，真皮層A431細(xì)胞中核仁與細(xì)胞核銀染面積灰度比值為8.264±2.04；治療組A431細(xì)胞內(nèi)AgNORs顆粒較對(duì)照組明顯減少(見圖1)，為5.234±1.74，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.對(duì)照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT組圖1　ALA-PDT對(duì)A431中AgNORs的影響 (熒光顯微鏡，×200)Figure 1　Effect of ALA-PDT on AgNORs in A431 cells (×200)

2.25-ALA-PDT對(duì)A431細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明：兩組細(xì)胞均以G0/G1期細(xì)胞為主峰，對(duì)照組A431中S期細(xì)胞峰高，為21.2%。PDT組S期、G2+M期細(xì)胞峰光滑平坦，S期比例顯著降低，PI含量顯著降低(見圖2)。兩組PI值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

組別G1期S期G2期PI對(duì)照組63.0±5.321.2±2.915.8±2.147.0±3.4ALA-PDT71.7±5.79.2±2.119.1±2.331.1±3.1*

與對(duì)照組比較,*P<0.05

A.對(duì)照組　　　　　　　　　　　　　　　　　　B.ALA-PDT組圖2　ALA-PDT治療后A431各期細(xì)胞比例分布Figure 2　The cell percentage distribution of A431 cells at each stage after treated with ALA-PDT

3討論

PDT殺傷腫瘤細(xì)胞可能的機(jī)制有以下幾種：PDT光能轉(zhuǎn)化過程中產(chǎn)生的單線態(tài)氧和ROS可以對(duì)很多大分子物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)、核酸等產(chǎn)生損害，引起細(xì)胞凋亡或壞死[3,4]；PDT損傷腫瘤血管的內(nèi)皮細(xì)胞，引起腫瘤血管栓塞，導(dǎo)致腫痛組織微循環(huán)障礙，腫瘤細(xì)胞缺血壞死[5]；PDT能夠刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對(duì)抗腫瘤細(xì)胞，比如，T淋巴細(xì)胞的功能對(duì)于維持PDT抗腫瘤的長(zhǎng)期療效是必需的。這幾種機(jī)制在PDT引起靶組織的破壞過程中都有一定的作用[7,8]。其作用因光敏劑的不同而不盡相同[9]。但是，至今對(duì)這些機(jī)制中PDT發(fā)揮的確切作用尚無明確的研究能夠表明。

目前研究發(fā)現(xiàn)由5-ALA引起的皮膚等正常組織的光敏作用只需要1-2 d就能被消除[10,11]。目前，5-ALA在皮膚癌、食道癌、胃腸道癌及肺癌等領(lǐng)域已經(jīng)研究相當(dāng)廣泛，并且已經(jīng)有相當(dāng)程度的臨床應(yīng)用。與目前的手術(shù)、化療或放療相比，其具有一定的對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性，具有對(duì)正常細(xì)胞損傷??；無蓄積毒性，可以多次使用，不產(chǎn)生耐藥性；副作用小，可安全應(yīng)用于老年人和體弱無法手術(shù)者等優(yōu)點(diǎn)。

A431細(xì)胞具有腫瘤細(xì)胞的特性，處于高增殖、高代謝和高分泌狀態(tài)。國外學(xué)者認(rèn)為A431細(xì)胞中AgNORs較正常細(xì)胞增多，表明A431細(xì)胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄活躍，細(xì)胞處于高度增殖和蛋白合成分泌旺盛的狀態(tài)[12,13]。為了給細(xì)胞的快速生長(zhǎng)創(chuàng)造條件，A431細(xì)胞對(duì)某些糖類、氨基酸等的運(yùn)送能力比正常細(xì)胞要大，細(xì)胞膜在細(xì)胞與外環(huán)境物質(zhì)交換過程中起著重要作用[14,15]。A431細(xì)胞膜的通透性亦高于正常細(xì)胞，使ALA易于進(jìn)入A431細(xì)胞。

AgNORs可以早而精確地反映細(xì)胞的增殖能力和蛋白質(zhì)合成狀態(tài)，及核仁的結(jié)構(gòu)和功能變化。我們的研究將A431細(xì)胞與5-ALA避光孵育后行PDT治療，通過計(jì)算AgNORs的相對(duì)含量來評(píng)估治療效果。細(xì)胞銀染后在鏡下觀察到，對(duì)照組A431細(xì)胞中核仁濃染、染色質(zhì)增多增粗、分布不均，說明A431細(xì)胞核酸代謝強(qiáng)，細(xì)胞DNA合成速度快，含量高。而PDT組細(xì)胞AgNORs減少，細(xì)胞核仁與細(xì)胞核銀染面積比值較對(duì)照組明顯降低，表明5-ALA-PDT治療后，A431細(xì)胞中AgNORs的表達(dá)減少，亦即PDT能在一定程度上抑制體外培養(yǎng)A431細(xì)胞的增殖能力和代謝功能。細(xì)胞周期反映單個(gè)細(xì)胞的生長(zhǎng)過程，正常皮膚細(xì)胞主要分布在靜止期(G0、G1期)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，對(duì)照組A431處于增殖狀態(tài)(G2、S和M期)，其中S期細(xì)胞百分比達(dá)到(21.2 ±2.9)%。由于S期是細(xì)胞增長(zhǎng)的重要時(shí)期，其主要特征是DNA合成旺盛，因此高比例的S期細(xì)胞，反映細(xì)胞的增殖活躍。經(jīng)ALA-PDT治療后，A431細(xì)胞的DNA合成前期持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，處于G0/G1期的細(xì)胞比例升高，而處于DNA合成期的細(xì)胞比例降低，表明ALA-PDT可以延緩A431細(xì)胞由G1期向S期的過渡，使大多數(shù)細(xì)胞停滯于DNA合成前期，導(dǎo)致DNA合成障礙，最終致使細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)減慢，A431細(xì)胞的倍增時(shí)間延長(zhǎng)，這與鏡下觀察到的AgNORs表達(dá)變化相一致。同時(shí)，兩組A431細(xì)胞的PI值亦相應(yīng)下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果皆表明ALA-PDT改變了各期細(xì)胞的分布比例，抑制A431細(xì)胞增殖。

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Effect of photodynamic therapy on the proliferation and cell cycle of human squamous carcinoma A431 cells

QIAO Li1, YANG Zhiyong1, XU Chengshan2, LIU Wei1

(1DepartmentofDermatology,AirForceGeneralHospitalPLA,Beijing100142,China；2CentralLaboratory,AirForceGeneralHospitalPLA)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of ALA-PDT on the proliferation and cell cycle of A431 cells. MethodsA431 cells were cultured and divided into two groups. The cultured cells were treated with ALA-PDT in one group(ALA-PDT group), and not treated in the other group(control group). The relative surface of argyrophilic protein in nucleolar organizer regions(AgNORs) was calculated after argyrophilic staining．Flow cytometry was applied to analyze the cell cycle and proliferation index(PI)．ResultsThe relative surface of AgNORs in A431 cells was reduced markedly after ALA-PDT treatment. The cell percentage in S stage was decreased to(9.2±2.1)% in ALA-PDT group, significantly lower than in control group. PI in ALA-PDT group was less than that in control group[(47.0±3.4)% vs (31.1±3.1)%,P<0.05].ConclusionALA-PDT can inhibit the proliferation of A431 cells and change cell cycle of A431 cells.

Key words:photodynamic therapy;epidermal squamous cell carcinoma;proliferation index;argyrophilic protein;cell cycle

[收稿日期：2015-07-10]

作者簡(jiǎn)介：?jiǎn)帖?，女?979-01生，博士，主治醫(yī)師，E-mail：winhp2006@163.com.

中圖分類號(hào)：R730.261

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007-6611(2016)01-0051-04

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.012