鄭　琪， 張　茜， 張　彧， 廖子君， 姚　煜， 南克俊(西安交通大學醫(yī)學院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安　7006；西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

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CAC1對胃癌細胞系AGS細胞周期的調(diào)控作用

鄭琪1， 張茜1， 張彧1， 廖子君1， 姚煜2， 南克俊2(1西安交通大學醫(yī)學院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安710061；2西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

摘要：目的研究新基因CAC1對胃癌細胞系AGS的細胞周期和細胞周期相關基因表達的調(diào)控作用。方法將AGS細胞分為空白對照組、陰性對照組和干擾組，分別給予細胞培養(yǎng)液、陰性對照siRNA和有效的CAC1-siRNA處理，用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，實時定量PCR和Western blot法檢測細胞周期相關基因(p53、cyclin A、cyclin E及CDK2)在mRNA和蛋白水平的表達變化。結果CAC1沉默后，流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，RNA干擾組的AGS細胞G1期細胞比例[(73.23±3.04)%]較對照組[(45.33±0.82)%]明顯增加(P<0.05)，S期細胞比例[(5.40±5.83)%]較對照組[(41.07±1.07)%]顯著減少(P<0.05)。CAC1沉默后，與對照組相比，干擾組無論是cyclin E的mRNA表達水平(1.000±0.000 vs 0.294±0.011,P<0.05)，還是cyclin A的mRNA表達水平(1.000±0.000 vs 0.886±0.039,P<0.05)，均出現(xiàn)了明顯的下降，p53 mRNA表達水平顯著上升(1.000±0.000 vs 2.233±0.122,P<0.05)，CDK2mRNA表達水平無明顯變化(1.000±0.000 vs 0.952±0.007,P>0.05)。類似地，CAC1沉默后，與對照組相比，干擾組的cyclin E蛋白表達水平(0.667±0.236 vs 0.165±0.046,P<0.05)和cyclin A蛋白表達水平(0.607±0.284 vs 0.208±0.029,P<0.05)均出現(xiàn)了明顯的下降，P53蛋白表達水平出現(xiàn)了顯著的上升(0.326±0.054 vs 0.656±0.106,P<0.05)；而CDK2蛋白表達水平無明顯變化(0.864±0.175 vs 0.717±0.100,P>0.05)。結論CAC1可促進胃癌AGS細胞的G1/S期轉換，下調(diào)p53的表達，上調(diào)cyclin E和cyclin A的表達。

關鍵詞：胃癌；AGS細胞；CAC1；細胞周期

世界范圍內(nèi)每年大約有98.9萬人新診斷為胃癌，73.8萬人死于胃癌，胃癌的年發(fā)病人數(shù)在所有惡性腫瘤排第四位，年死亡人數(shù)排第二位，超過70%的胃癌發(fā)病和死亡患者都屬于發(fā)展中國家[1]。晚期轉移性的胃癌患者預后不良，中位生存期僅僅8-10個月，5年生存率不足7%[2]。胃癌具有相當高的發(fā)病率和死亡率，有必要深入地研究其病因和發(fā)病機制，以提高診斷和治療水平。

CDK-associated cullin 1 (CAC1)是2009年在結直腸癌中鑒定發(fā)現(xiàn)的一個新基因，研究發(fā)現(xiàn)，CAC1可促進大腸癌細胞增殖，推動細胞周期從G1期向S期轉換，它能夠特異性地和CDK2結合并提高其活性[3]。而且，CAC1在阿爾茨海默病患者的腦組織呈現(xiàn)低表達，并抑制氧化應激損傷所致的細胞凋亡[4]。進一步的研究還發(fā)現(xiàn)，大腸癌中去氧膽酸通過下調(diào)miR-199a-5p來增加CAC1的表達，進而促進腫瘤的進展和耐藥[5]。乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CAC1可與HDAC協(xié)同下調(diào)RARα的活性[6]，還可以作用于組蛋白脫甲基酶LSD1，從而下調(diào)ERα[7]。肺癌中的研究發(fā)現(xiàn)，CAC1通過激活肺癌A549細胞中的ERK1/2促進腫瘤細胞增殖[8]。

本課題組前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，CAC1在胃癌細胞系中的表達水平高于胃黏膜細胞，它還能促進細胞增殖，調(diào)控凋亡相關基因的表達來抑制順鉑誘導的細胞凋亡[9]，但它對胃癌細胞周期的影響和其機制仍需要深入研究。因此，本文通過RNA干擾法沉默胃癌AGS細胞系中CAC1的表達，觀察細胞周期和細胞周期相關基因表達的變化，分析和探討CAC1對胃癌細胞周期的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1細胞實驗材料及主要試劑

高表達CAC1基因的人胃癌細胞系AGS[9]購自中科院上海細胞庫，LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司，碘化丙啶(PI)購自美國sigma公司，Rnase購自美國Sigma公司，CDK2鼠單克隆抗體、Cyclin A鼠單克隆抗體、Cyclin E鼠單克隆抗體、p53鼠單克隆抗體、β-actin鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。10%新生小牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，胰蛋白酶購自寶信生物，EDTA購自北京鼎國公司，DMSO購自美國Sigma公司，Trizol購自美國Invitogen公司，逆轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，PrimeScriptTM1st Strand cDNA合成試劑盒購自美國Invitogen公司。

1.2脂質(zhì)體轉染CAC1-siRNA入AGS細胞

CAC1的siRNA干擾序列和陰性對照siRNA序列(negative control siRNA,NC-siRNA)，由上海GenePharma公司化學合成，具體序列如下。siRNA sense：5′-GGA UGG UGC CAU AGA UCA ATT-3′，siRNA antisense：5′-UUG AUC UAU GGC ACC AUC CGG-3′，NC-siRNA sense：5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，NC-siRNA antisense：5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。實驗組為siRNA組和NC-siRNA組，將兩種RNA干擾序列與不含血清的細胞培養(yǎng)液混勻，設置平行孔和對照組，對照組為胃癌AGS細胞(cell)組和單加脂質(zhì)體(lipo)組。轉染前將脂質(zhì)體與相應劑量的無血清培養(yǎng)液混合，室溫下孵育5-30 min。將脂質(zhì)體與siRNA的混合液加入培養(yǎng)板，開始進行轉染，轉染6 h后移去轉染試劑，繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。取對數(shù)生長期的AGS細胞，加入60 nmol/L的CAC1-siRNA轉染細胞。

1.3流式細胞儀檢測細胞周期

轉染完成后，加入100 μg/ml的 PI染液100 μl，最后進入流式細胞儀檢測，細胞在488 nm處被氬激光激發(fā)，PI的紅色熒光通過630 nm濾光片收集，結果用美國B-D FACSort Cell Quest軟件做DNA分析。

1.4real-time PCR法檢測相關基因mRNA表達量

實驗分組依次為Control組、NC-siRNA組和siRNA組，siRNA轉染濃度為前期研究中的有效抑制濃度60 nmol/L[9]。引物序列由TaKaRa公司設計合成，具體如下。CDK2 forward：5′-TTC TGC CAT TCT CAT CGG-3′；CDK2 reverse：5′-ATG GGT GTA AGT ACG AAC AGG-3′；Cyclin A forward：5′-TCC AAG AGG ACC AGG AGA ATA TCA-3′,Cyclin A reverse：5′-TCC TCA TGG TAG TCT GGT ACT TCA-3′;Cyclin E forward：5′-CCT GTA CTG AGC TGG GCA AAT AGA-3′,Cyclin E reverse：5′-ACG AAG GTC CTG ACA CGT CAC GTA-3′；p53 forward：5′-CCA CCA TCC ACT ACA ACT ACA T-3′；p53 reverse：5′- AGG ACA GGC ACA AAC ACG-3′；β-actin forward：5′-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3′；β-actin reverse：5′-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3′，提取總RNA，逆轉錄，實時定量PCR檢測各基因mRNA表達水平。

1.5Western blot法檢測相關基因mRNA表達量

提取細胞總蛋白，制備蛋白電泳樣品，丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸纖維素膜蛋白遷移，將膜放入一個可以封口的塑料雜交袋中，依次加入稀釋的一抗和二抗。將膜放入玻璃皿中，加入已配好的化學發(fā)光底物，置于Syngene G Box凝膠成像儀的暗箱中拍照。結果應用美國Image J軟件分析，計算每個條帶的積分光密度(OD)值，進行半定量分析。采用各目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度比值(targeted protein/β-actin)來表示目的蛋白的相對表達水平。1.6統(tǒng)計學分析

2結果

2.1CAC1沉默對細胞周期的影響

流式細胞儀分析了對照組、NC-siRNA組和siRNA組AGS細胞周期(見圖1)。與對照組[(45.33±0.82)%]相比，siRNA組G1期細胞比例[(73.23±3.04)%]明顯增加(P<0.05)，而S期細胞比例顯著下降[(5.40±5.83)%vs(41.07±1.07)%,P<0.05)]，G2期細胞比例較對照組輕度上升，但其變化無統(tǒng)計學意義[(21.37±2.88)%vs(13.61±0.46)%,P>0.05]。NC-siRNA組各期細胞比例與對照組相比，其差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1　CAC1沉默后細胞周期的變化(與對照組比較，*P<0.05)Figure 1　Changes of cell cycle after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

2.2CAC1沉默對周期相關基因表達的影響

從實時定量PCR結果可以看出，CAC1沉默組(siRNA組)與對照組(control group)相比，無論是cyclin E mRNA水平，還是cyclin A mRNA水平，均出現(xiàn)了顯著下降(P<0.05)；p53 mRNA表達水平在CAC1沉默后則發(fā)生了顯著的上升(P<0.05)；CDK2的mRNA表達水平在CAC1沉默前后的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時，陰性對照組(negative control group, NC-siRNA group)的mRNA表達水平與對照組比較無明顯變化(P>0.05，見圖2，表1)。

Western blot檢測結果顯示，AGS細胞中各細胞周期相關基因在蛋白水平的變化趨勢與mRNA水平變化趨勢基本一致。與對照組相比，CAC1沉默后，cyclin E蛋白表達水平和cyclin A蛋白表達水平均出現(xiàn)了明顯的下降(P<0.05)；P53蛋白表達水平則出現(xiàn)了顯著的上升(P<0.05)；而CDK2蛋白表達水平在CAC1沉默前后的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。同時，陰性對照組(NC-siRNA group)的蛋白表達水平與對照組比較無明顯變化(P>0.05，見圖3，表2)。

圖2　CAC1沉默后細胞周期相關基因mRNA表達(與對照組比較，*P<0.05)Figure 2　The mRNA expressions of cell cycle-related genes after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

表1CAC1沉默后凋亡相關基因mRNA表達水平的變化

Table 1Changes of apoptosis-associated genes expression at mRNA level after CAC1 silencing

組別 p53cyclinEcyclinACDK2CAC1沉默組2.233±0.1220.294±0.0110.886±0.0390.952±0.007對照組1.000±0.0001.000±0.0001.000±0.0001.000±0.000P0.0000.0000.0100.925

A.CAC1沉默后細胞周期相關蛋白印跡圖　　　　　　B.CAC1沉默后細胞周期相關蛋白定量分析圖圖3　CAC1沉默后細胞周期相關蛋白表達變化(與對照組比較，*P<0.05)Figure 3　Expression of cell cycle-related proteins after CAC1 silencing(vs control group,*P<0.05)

表2CAC1沉默后細胞周期相關基因蛋白表達水平的變化

Table 2Changes of cell cycle-associated genes expression at protein level after CAC1 silencing

組別P53CyclinECyclinACDK2CAC1沉默組0.656±0.1060.165±0.0460.208±0.0290.717±0.100對照組0.326±0.0540.667±0.2360.607±0.2840.864±0.175P0.0060.0320.0410.207

3討論

CAC1是在結直腸癌中發(fā)現(xiàn)的一個新基因，它定位于人類第10號染色體的10q25-q26，翻譯的蛋白由369個氨基酸組成，在其137-250位氨基酸之間包含有一個cullin樣的功能域，故被歸類為cullin家族成員[3]。結直腸癌中的研究顯示，CAC1在腫瘤細胞和組織中的表達水平高于相應的正常細胞和組織；CAC1的表達與患者年齡、腫瘤部位及轉移無關，與結直腸癌的病理類型及臨床分期有關；CAC1可調(diào)控細胞周期，促進腫瘤細胞增殖[3]。但有關它在胃癌組織和細胞中的功能研究較少。本課題組前期的研究提示，CAC1在胃癌細胞系中的表達水平高于胃黏膜細胞，并能夠抑制順鉑誘導的細胞凋亡[9]。

細胞的增殖依賴于高效有序的細胞周期，CAC1在胃癌AGS細胞系中表現(xiàn)出促進細胞增殖的作用，提示它可能直接或間接影響了細胞周期的進程。細胞周期是指每一次有絲分裂的結束到下一次有絲分裂的結束。完整的細胞周期包括DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。細胞周期啟動的主要調(diào)控點在G1期，特別是在G1晚期存在一個限制點(restriction point)，一旦通過該限制點，細胞就能依次完成剩下的G1、S、G2、M期，而不依賴于生長因子的持續(xù)刺激。如果細胞在G1期缺乏相應生長因子，則細胞周期將停止在限制點，細胞進入“安靜”狀態(tài)，稱為G0期。S期細胞所占比例大小，可以表明開始新一輪DNA復制合成和分裂的細胞數(shù)量的多少。

通過流式細胞儀發(fā)現(xiàn)，CAC1沉默后，AGS細胞G1/G0期比例增加了約28%，而S期細胞比例下降了約36%，G2/M期細胞比例變化不明顯，即細胞周期在G1期發(fā)生阻滯。這與此前在宮頸癌HeLa細胞中的研究結果一致[3]，這說明CAC1在細胞周期的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，能夠促進AGS細胞通過G1期進入S期，進而推動細胞周期演進，促進細胞增殖。

細胞周期調(diào)控機制的核心是一組蛋白激酶在細胞周期內(nèi)特定時相激活，通過對相應的底物磷酸化來驅(qū)動細胞完成細胞周期。這些蛋白激酶的細胞周期特異性激活，依賴于一類細胞周期特異性表達、累積和降解的蛋白質(zhì)即細胞周期素(cyclins)，故而前者被稱為細胞周期依賴性蛋白激酶(CDK)。目前人類細胞主要的cyclins有8類共11種[10,11]；主要的CDK有CDK1、CDK2、CDK4和CDK6。Cyclins與相應的CDKs結合后，二者形成的功能復合體才能使細胞周期有序進行。一般而言，CDK4、CDK6與cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3的結合是G1期運行的必要條件；CDK2與cyclin E的結合是S期啟動的必要條件；CDK2還可以與cyclin A的結合，是G2期啟動和進行的必要條件；CDK1與cyclin B1的結合對M期啟動和進行是必需的條件[12]。

研究中檢測了與細胞周期調(diào)控關系密切的cyclin E、cyclin A和CDK2的變化。cyclin E的mRNA和蛋白表達水平在CAC1沉默后出現(xiàn)了明顯的下降。同時，CDK2的mRNA和蛋白表達量均無明顯變化。故CAC1可能對cyclin E的表達具有上調(diào)作用，而對CDK2的表達無明顯影響。

實驗中CAC1的沉默引起了cyclin E表達水平的明顯下降，提示CAC1可能促進cyclin E的表達。另外，對HeLa細胞的研究中觀察到，CAC1水平從G0期開始逐漸上升，至S期表達水平達到高峰，S中期開始下降，至S/G2期又再次升高，到達G0期后表達最低；其表達定位也隨著細胞周期的變化而改變，G0、M期主要定位在細胞質(zhì)，S期主要定位于細胞核；同時，cyclin E的表達從G1中期開始升高，至G1/S交界處達高峰，細胞進入S期后，cyclin E開始下降，到G2/M期降為零[3]?？梢?，CAC1的下調(diào)引起cyclin E的下調(diào)，且CAC1與cyclin E在G1/S期表達最高的峰值存在重疊，CAC1很可能直接或間接上調(diào)cyclin E的表達。

免疫共沉淀法已經(jīng)證實，CAC1能夠與CDK2結合并提高CDK2的活性，但不影響CDK2的表達量[3]。本研究也證實了CDK2無論在mRNA水平還是在蛋白水平，其表達不受CAC1表達變化的影響。CAC1一方面可以上調(diào)cyclin E的表達，另一方面還能增加CDK2的活性。由于cyclin E/CDK2復合體的形成對細胞跨過G1期進入S期是必需的限速步驟之一[13]，所以，CAC1可能通過增加cyclin E/CDK2復合體的數(shù)量或活性來促進G1/S期轉變。

CAC1沉默后cyclin A的mRNA和蛋白表達水平也出現(xiàn)了一定程度的下降，但其下降幅度遠低于cyclin E。Cyclin A表達升高一般發(fā)生于G1/S期轉變期，并持續(xù)整個S期；它與CDK2結合，使DNA持續(xù)合成；在S期后期，它與CDK1發(fā)生聯(lián)系[13]。cyclin A與CDK2的結合是G2期啟動和進行的必需條件，CAC1沉默所帶來的二者表達或活性的下降可能使細胞阻滯于S期，但本研究中未發(fā)現(xiàn)S期細胞阻滯和G2期細胞比例的下降。可能是CAC1沉默對cyclin E/CDK2的負向調(diào)節(jié)作用大大超過了對cyclin A/CDK2的下調(diào)作用，故在AGS細胞中僅表現(xiàn)為cyclin A表達水平的下調(diào)，未出現(xiàn)S期阻滯。

有趣的是，CAC1對抑癌基因p53的表達起負調(diào)節(jié)作用。無論是mRNA還是蛋白質(zhì)的表達量，P53在CAC1沉默后都出現(xiàn)了明顯的增加。這些結果提示，AGS細胞在CAC1沉默后出現(xiàn)了G1期阻滯，不但與cyclin E的下調(diào)和CDK2活性的下降有關，而且可能與P53的表達上調(diào)有關。P53對于細胞基因組完整性的維持具有重要作用。文獻指出，P53對細胞周期的影響主要體現(xiàn)在它增加其靶基因p21的轉錄，而P21蛋白是多種CDK抑制劑(CDK2,CDK4,CDK6)。當DNA發(fā)生損傷時，P53還可以通過抑制激酶的活性來阻礙Rb的磷酸化，結果使細胞停滯于G1期進行DNA修復；如果DNA損傷程度超過了細胞修復能力，P53可誘導細胞發(fā)生凋亡[13]。而且，野生型的P53還可以抑制cyclin A的表達[14]。

CAC1是如何引起cyclin E、cyclin A和p53等基因表達改變的，其具體的調(diào)控機制還需要進一步的深入研究。首先，文獻報道，CDK2活性的抑制可導致ATM-和ATR-依賴的P53第15位serine上發(fā)生磷酸化，從而引起P53和P21蛋白表達的明顯升高[15]，CAC1的表達下調(diào)可引起CDK2活性下降，從而造成P53水平上升。其次，P53已經(jīng)證實對cyclin A的表達具有抑制作用，故CAC1沉默引起的P53上調(diào)可能會導致cyclin A表達下降。最后，cyclin E是E2F的靶基因之一，它的啟動子上游有E2F的結合位點[13]；CAC1可能通過直接過間接的方式使Rb磷酸化，Rb磷酸化水平增高可引起E2F釋放并作用于包括cyclin E在內(nèi)的下游靶基因[13]，進而增加cyclin E的轉錄和翻譯。

綜上所述，CAC1可通過調(diào)控細胞周期相關基因的表達，促進細胞從G1期向S期轉變，從而加快分裂增殖。另外，CAC1沉默后，AGS細胞中cyclin E、cyclin A和P53的表達均在mRNA水平上發(fā)生了明顯的變化，故CAC1對上述基因的調(diào)控可能是轉錄前調(diào)控。

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Exploration on the role of CAC1 in the regulation of cell cycle of AGS gastric cancer cell line

ZHENG Qi1, ZHANG Qian1, ZHANG Yu1, LIAO Zijun1, YAO Yu2, NAN Kejun2

(1FirstDepartmentofMedicalOncology,AffiliatedShaanxiProvincialCancerHospital,CollegeofMedicine,Xi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofMedicalOncology,FirstAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversity)

Abstract：ObjectiveTo investigate the role of novel gene CAC1 in regulating cell cycle and cell cycle-related genes expression of gastric cancer cell line AGS.MethodsAGS cells were divided into blank control group, negative control group and RNA interference group, which were treated with cell culture fluid, negative control siRNA and effective CAC1-siRNA, respectively. The cell cycle changes were analyzed by flow cytometry, and the expression of cell cycle-related genes(p53, cyclin A, cyclin E and CDK2) at mRNA and protein levels were detected by real-time PCR and Western blot, respectively. ResultsAfter CAC1 expression was effectively silenced by RNA interference in AGS cells, the cell proportion in G1 phase[(73.23±3.04)%] increased remarkably compared with control group[(45.33±0.82)%,P<0.05)], and the cell proportion in S phase decreased significantly[(5.40±5.83)% vs (41.07±1.07)%,P<0.05]. In addition, both cyclin E mRNA expression(0.294±0.011 vs 1.000±0.000,P<0.05) and cyclin A mRNA expression (0.886±0.039 vs 1.000±0.000,P<0.05) were significantly down-regulated after CAC1 silencing, p53 mRNA expression increased significantly (2.233±0.122 vs 1.000±0.000,P<0.05), and CDK2 mRNA expression had no significant change(0.952±0.007 vs 1.000±0.000,P>0.05). Likewise, both cyclin E protein expression(0.165±0.046 vs 0.667±0.236,P<0.05) and cyclin A protein expression(0.208±0.029 vs 0.607±0.284,P<0.05) were dramatically down-regulated after CAC1 silencing,P53 protein expression increased(0.656±0.106 vs 0.326±0.054,P<0.05), and CDK2 protein expression had no significant change(0.717±0.100 vs 0.864±0.175,P>0.05).ConclusionCAC1 can promote G1/S transition, down-regulate P53 expression and up-regulate cyclin E and cyclin A expression in AGS gastric cancer cell line.

Key words:gastric cancer;AGS cells;CAC1;cell cycle

[收稿日期：2015-08-28]

作者簡介：鄭琪，男， 1979-03生，博士，主治醫(yī)師E-mail：snowpinezq@163.com.

中圖分類號：R735.2

文獻標志碼：A

文章編號：1007-6611(2016)01-0035-06

DOI：10.13753/j.issn.1007-6611.2016.01.009