柯潤輝，王麗娟，安紅梅，黃新望，尹建軍，宋全厚

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京，100015)

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超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑

柯潤輝1,2*，王麗娟1,2，安紅梅1,2，黃新望1,2，尹建軍1,2，宋全厚1,2

1(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京，100015) 2(國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京，100015)

摘要建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(ultra performance liguid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜和甜菊糖苷)含量的新方法。樣品經(jīng)超純水稀釋2倍，微孔濾膜過濾后直接進(jìn)樣，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liguid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)進(jìn)行定量分析。Waters HSS T3色譜柱為分析柱，甲醇-0.1%乙酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧電離源正負(fù)離子切換多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式檢測(cè)。結(jié)果表明：氨基甲酸乙酯和8種甜味劑在3～500 μg/L的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(相關(guān)系數(shù)r>0.998)，方法檢出限在1～3 μg/L，基質(zhì)加標(biāo)回收率在89%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤9%，完全滿足日常檢測(cè)的要求。該方法前處理簡單，測(cè)定快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，非常適合白酒中氨基甲酸乙酯和多種甜味劑的快速篩查和定量分析。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀；白酒；氨基甲酸乙酯；甜味劑

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate，EC)是發(fā)酵食品在發(fā)酵和貯存過程中天然產(chǎn)生的化學(xué)污染物[1]。2007年，世界衛(wèi)生組織的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International Agency for Research on Cancer，IARC)正式將氨基甲酸乙酯歸為2A類致癌物(對(duì)人類為很可能致癌物), 認(rèn)為經(jīng)食物和飲料酒攝入的EC總量，可能對(duì)健康造成潛在危險(xiǎn)[2]。甜味劑是一類重要的食品添加劑，用以改善食品口感和風(fēng)味，其中非糖類甜味劑由于高甜度、低熱量、多不參與代謝過程等優(yōu)點(diǎn)而成為蔗糖的代用品在現(xiàn)代食品工業(yè)中普遍應(yīng)用，但對(duì)人工甜味劑的安全性認(rèn)識(shí)和使用限量的規(guī)定一直是各國政府和相關(guān)機(jī)構(gòu)關(guān)注的熱點(diǎn)。

雖然我國尚未制定酒精飲料中氨基甲酸乙酯的限量標(biāo)準(zhǔn)，但白酒中氨基甲酸乙酯問題已經(jīng)引起行業(yè)的關(guān)注，成為生產(chǎn)企業(yè)日常監(jiān)控的重點(diǎn)指標(biāo)。品質(zhì)優(yōu)良的白酒由于其復(fù)雜特殊的釀造工藝，在發(fā)酵過程中就能產(chǎn)生一些醇甜物質(zhì)(高級(jí)醇、多元醇、氨基酸等)，適度的甜味不僅可以遮蓋酒類發(fā)酵過程中的苦澀等雜味，而且能使酒醇厚，綿軟。為了保護(hù)我國傳統(tǒng)產(chǎn)品，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定白酒不允許添加任何甜味劑[3]，但個(gè)別生產(chǎn)企業(yè)為了降低成本，掩蓋其產(chǎn)品的口感缺陷，仍違規(guī)添加甜味劑。隨著我國食品安全監(jiān)管水平的提升，為提高工作效率，方便監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯和甜味劑的日常監(jiān)測(cè)，開發(fā)靈敏度高、適用性廣的高通量檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，酒中氨基甲酸乙酯的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[4]、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜法[6]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等；白酒中甜味劑的檢測(cè)方法主要有離子色譜法[9]、氣相色譜法[10]、液相色譜法[11]、氣相色譜-質(zhì)譜法[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13]等。雖然相關(guān)檢測(cè)方法的報(bào)道很多，但經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未見到同時(shí)測(cè)定酒中氨基甲酸乙酯和多種甜味劑的方法報(bào)道。由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的高選擇性與高靈敏度，其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用越來越廣。本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯和安賽蜜、甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、紐甜、阿力甜、甜菊糖苷8種常見甜味劑的方法，簡便、快速、靈敏度高，為大批量的白酒監(jiān)督抽查和企業(yè)日常監(jiān)控提供及時(shí)準(zhǔn)確可靠的技術(shù)手段，并大大提高工作效率和降低檢測(cè)成本。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

超高效液相色譜儀-三重四極桿質(zhì)譜儀(ACQUITY TQD), 美國Waters公司；Masslynx 4.1質(zhì)譜色譜管理軟件；超純水儀，美國Merck Millipore公司；0.22 μm尼龍濾膜，上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸、乙酸銨(HPLC級(jí))，Dikma公司；氨基甲酸乙酯，德國Dr. Ehrenstorfer公司；甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、紐甜、阿力甜，美國Sigma-Aldrich公司和加拿大TRC公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取氨基甲酸乙酯、甜蜜素、安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、三氯蔗糖、甜菊糖苷、紐甜和阿力甜標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容(其中氨基甲酸乙酯用甲醇溶解定容)，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確移取各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.5 mL，混合于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋配制成5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后再逐級(jí)稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2.2樣品溶液的制備

取白酒樣品5.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22 μm濾膜，濾液供測(cè)定。

1.2.3LC條件

使用Waters BEH HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)。流動(dòng)相由甲醇和0.1%乙酸水溶液組成，流速0.35 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)椋? min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為10 %；0～4 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從10%升至90%，并保持0.5 min；4.5～4.51 min，甲醇的體積分?jǐn)?shù)從90%降至10 %；4.51～6.5 min,甲醇的體積分?jǐn)?shù)保持10%。柱溫為40 °C；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.2.4MS/MS條件

質(zhì)譜儀選用電噴霧離子源，根據(jù)被測(cè)物在正、負(fù)離子模式下的靈敏度不同而分類檢測(cè)，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multi-reactions monitoring，MRM)定量。質(zhì)譜采用正、負(fù)離子模式時(shí)，毛細(xì)管電壓分別為1.0 kV和2.9 kV，脫溶劑氣和錐孔氣流量分別設(shè)為700 L/h和50 L/h，離子源溫度和脫溶劑氣溫度分別為110 ℃和400 ℃。

2結(jié)果與討論

2.1色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1色譜條件的選擇

C18填料液相柱在氨基甲酸乙酯和甜味劑檢測(cè)中應(yīng)用較多[8,11,13-14]，考慮到流動(dòng)相緩沖鹽pH值為酸性，本研究比較了BEH C18柱和BEH HSS T3柱對(duì)氨基甲酸乙酯和8種甜味劑的分離效果, 發(fā)現(xiàn)兩款柱子均能較好地分離9種被測(cè)物，但在同等條件下，BEH HSS T3柱的分離效果更佳。由于某些被測(cè)物極性較強(qiáng)，流動(dòng)相的洗脫能力不宜過強(qiáng)，同時(shí)乙腈的毒性較甲醇大；又由于流動(dòng)相要進(jìn)入質(zhì)譜儀，添加一定量的緩沖鹽可以增加響應(yīng)值；所以考慮甲醇-水、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動(dòng)相體系。以被測(cè)物在色譜柱上的分離度、峰形、靈敏度等為考察指標(biāo)對(duì)三種流動(dòng)相體系進(jìn)行了比較。結(jié)果表明, 從各物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時(shí)間的穩(wěn)定性等指標(biāo)進(jìn)行綜合衡量，0.1%乙酸-甲醇做為流動(dòng)相時(shí)優(yōu)于其余兩種流動(dòng)相, 故實(shí)驗(yàn)選用0.1%乙酸-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

2.1.2質(zhì)譜條件的選擇

采用流動(dòng)注射直接連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜全掃描檢測(cè)，得到目標(biāo)分析物一級(jí)質(zhì)譜圖，再用氬氣轟擊該母離子，得到其二級(jí)質(zhì)譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨基甲酸乙酯在正離子模式下響應(yīng)值高于負(fù)離子模式，而8種甜味劑均在負(fù)離子模式中有較高響應(yīng)，因此，本研究選擇正負(fù)離子切換監(jiān)測(cè)的方式，正離子模式監(jiān)測(cè)氨基甲酸乙酯，負(fù)離子模式監(jiān)測(cè)甜味劑。除氨基甲酸乙酯、甜蜜素和甜菊糖苷的母離子裂解時(shí)只能得到1個(gè)明顯的碎片子離子外(表1)，其余6種被測(cè)物均獲得了豐富的碎片離子。利用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式對(duì)各被測(cè)物的定性和定量離子對(duì)進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化，所得最佳質(zhì)譜條件參數(shù)見表1。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下9種被測(cè)物的總離子流(TIC)色譜圖見圖1。

表1　氨基甲酸乙酯和8種甜味劑的質(zhì)譜分析參數(shù)

1-氨基甲酸乙酯(1.65min); 2-安賽蜜(1.57 min); 3-糖精鈉(1.97 min); 4-甜蜜素(2.57 min); 5-三氯蔗糖(2.79 min);　　　6-阿斯巴甜(2.87 min); 7-阿力甜(3.37 min);　　　　8-紐甜(4.26 min); 9-甜菊糖苷(4.59 min)圖1　氨基甲酸乙酯和8種甜味劑(質(zhì)量濃度為200 μg/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1　TIC chromatograms of EC and 8 sweeteners standard solution (200 μg/L)

2.1.3樣品前處理?xiàng)l件的選擇

白酒基質(zhì)相對(duì)較簡單，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)在抗基質(zhì)干擾、靈敏度方面有較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，因此可在LC-MS/MS上直接進(jìn)樣分析。但考慮到白酒含有高比例的乙醇，若直接進(jìn)樣分析，乙醇會(huì)影響極性較大的被測(cè)物(氨基甲酸乙酯和安賽蜜)在反相C18柱上的保留時(shí)間和峰形，導(dǎo)致保留時(shí)間偏移，影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。為了消除乙醇對(duì)檢測(cè)的影響，可采用加水稀釋、氮吹或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方法，考慮到氮吹和旋蒸操作相對(duì)復(fù)雜和耗時(shí)，本研究采用加水稀釋的方式。稀釋的方法可以降低乙醇對(duì)色譜峰形影響，減弱基質(zhì)效應(yīng)，但是會(huì)降低方法的檢出限。經(jīng)過不同稀釋倍數(shù)樣品測(cè)試對(duì)比，最終確定稀釋倍數(shù)為2倍。

2.2方法的線性范圍和檢出限

因白酒的基質(zhì)效應(yīng)不明顯[14]，本研究采用直接配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線來考察方法的線性和檢出限。將含9種被測(cè)物的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度為3、10、20、100、500 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，按上文2.1部分所確定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，以目標(biāo)物的峰面積對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度繪制各被測(cè)物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性相關(guān)系數(shù)(r)都在0.998以上。用信噪比為3確定方法的檢出限(LOD)，具體參數(shù)見表2。

表2　9種被測(cè)物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.3精密度和回收率

準(zhǔn)確吸取一定量某白酒樣品，用微量移液器準(zhǔn)確加入一定量的9種待測(cè)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成100 μg/L水平進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，按1.2節(jié)所述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和測(cè)定，進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)算其回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明，白酒中9種待測(cè)物的回收率在89%～106%，RSD小于9%(表3)，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表3　白酒中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑的添加

注：-為未檢出。

2.4實(shí)際樣品的測(cè)定

按所建立的方法對(duì)從市場(chǎng)上購買的8個(gè)品牌白酒樣品(涵蓋醬香、濃香、清香、董香、芝麻香和老白干香型)和搜集的2個(gè)甜味劑陽性白酒樣品進(jìn)行了檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。所檢白酒中均檢出一定量的EC，部分白酒中檢出一定量的安賽蜜、紐甜、糖精鈉、甜菊糖苷等(表4)。圖2為9號(hào)白酒樣品氨基甲酸乙酯和有檢出甜味劑的質(zhì)譜圖。

表4　市售白酒樣品中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑的檢測(cè)結(jié)果(n=3)　單位：μg/L

注：-為未檢出。

圖2　某白酒樣品中檢出的氨基甲酸乙酯和甜味劑質(zhì)譜圖Fig.2　MRM chromatograms of detected EC and sweeteners in one Chinese distilled spirit sample

3結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀同時(shí)測(cè)定白酒中氨基甲酸乙酯和8種甜味劑含量的方法，前處理簡單、分離度好、準(zhǔn)確度和靈敏度高。實(shí)際樣品的檢測(cè)表明，該方法能夠滿足白酒中氨基甲酸乙酯和多種痕量甜味劑殘留的分析要求，與國標(biāo)方法相比，大大提高了分析效率和降低了分析成本。本方法的建立為監(jiān)管部門和生產(chǎn)企業(yè)對(duì)白酒中氨基甲酸乙酯和甜味劑的日常監(jiān)測(cè)提供了可靠、準(zhǔn)確、高效的技術(shù)手段，對(duì)提升我國白酒行業(yè)安全監(jiān)管水平具有重要意義。

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Simultaneous determination of ethyl carbamate and eight sweeteners in Chinese distilled spirit by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

KE Run-hui1, 2*, WANG Li-juan1, 2, AN Hong-mei1, 2, Huang Xin-wang1, 2,YIN Jian-jun1, 2, SONG Quan-hou1, 2

1(China National Research Institute of Food & Fermentation Industries, Beijing 100015, China) 2(National Food Quality Supervision and Inspection Center, Beijing 100015, China)

ABSTRACTAn ultra performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometric (UPLC-ESI-MS/MS) method was established for the simultaneous determination of ethyl carbamate and eight sweeteners in Chinese distilled spirit. The samples were diluted with distilled water, and then filtered through 0.22 μm microporous membrane. The LC separation was performed on a Waters Acquity UPLC system with a HSS T3 column, and 0.1% (v/v) acetic acid/methanol were used as mobile phase for gradient elution. After LC separation, MS/MS was adopted for multiple reaction monitoring mode (MRM). The calibration curves showed good linearity in the range of 3 μg/L to 500 μg/L with the correlation coefficients greater than 0.998. The limits of detection (LODs) were between 1μg/L to 3μg/L. The matrix recoveries were within 89%-106% and the relative standard deviations (RSD) were lower than 9%. The results indicated that the proposed method was easier, faster, more sensitive, and suitable for the qualitative and quantitative confirmation of ethyl carbamate and sweeteners in Chinese distilled spirit.

Key wordsultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-ESI-MS/MS); Chinese distilled spirit; ethyl carbamate; sweeteners

收稿日期：2015-12-08，改回日期：2015-12-28

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604031

第一作者：碩士研究生(柯潤輝高級(jí)工程師為通訊作者，E-mail: runhuike@163.com)。