雷微　鄧明明

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科, 四川 瀘州 646000)

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·論著·

miR-217通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究*

雷微鄧明明

(四川醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化科, 四川 瀘州 646000)

【摘要】目的探討miRNA-217(miR-217)抑制胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其機(jī)制。方法qRT-PCR法比較胃癌組織、癌旁組織、胃癌細(xì)胞系和正常胃上皮細(xì)胞中miR-217的表達(dá)差異。轉(zhuǎn)染miR-217 mimics或Inhibitors后，通過Transwell侵襲實驗觀察miR-217的胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響；建立裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移模型，觀察穩(wěn)定表達(dá)miR-217在體內(nèi)對胃癌轉(zhuǎn)移能力的影響；生物信息學(xué)分析miR-217的候選靶基因為14-3-3ν，熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測SGC7901細(xì)胞中miR-217過表達(dá)對野生型和突變型14-3-3ν熒光素酶活性的影響。Western blot檢測miR-217對14-3-3ν野生型和突變體蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果miR-217在胃癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.01)；在各胃癌細(xì)胞中的表達(dá)量較正常胃上皮細(xì)胞GES顯著降低(P<0.01)。miR-217 mimics抑制SGC7901細(xì)胞的侵襲能力，與陰性對照的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而miR-217 inhibitors明顯促進(jìn)SGC7901細(xì)胞的侵襲能力(P<0.01)；體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達(dá)miR-217的SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力明顯降低。熒光素酶報告基因結(jié)果證實miR-217能夠抑制14-3-3ν的3′-UTR區(qū)熒光素酶活性；Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-217后，SGC7901細(xì)胞中的14-3-3ν蛋白水平明顯低于對照組；Western blotting結(jié)果顯示miR-217過表達(dá)顯著抑制14-3-3ν-wt，而不能抑制14-3-3ν-mut的蛋白表達(dá)。結(jié)論miR-217能夠通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉(zhuǎn)移，促進(jìn)miR-217的表達(dá)或抑制14-3-3ν的表達(dá)可能是抑制胃癌轉(zhuǎn)移的有效手段。

【關(guān)鍵詞】胃癌；轉(zhuǎn)移；微小RNA；微小RNA-217；14-3-3ν

胃癌是我國的主要惡性腫瘤之一，占腫瘤相關(guān)死亡人數(shù)占42.5%，是各類癌癥死亡率的第三位[1]。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)胃癌時已發(fā)生臨近器官或者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，成為胃癌患者的主要死因。微小RNA(miRNA，miR)，即20-24個核苷酸的是近年來發(fā)現(xiàn)的一類通過與靶基因的mRNA發(fā)生特異性結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后負(fù)性調(diào)控作用的非編碼小RNA[2]。多種miRNA已被證實通過調(diào)控下游靶基因，在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3, 4]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-217能夠靶向KRAS抑制胰腺癌生長[5]，miR-217還能夠靶向E2F3抑制肝癌轉(zhuǎn)移[6]。然而，miR-217在胃癌中的作用尚不清楚。本研究通過探索miR-217在胃癌轉(zhuǎn)移過程中的作用及其分子機(jī)制，為抑制胃癌轉(zhuǎn)移提供新的有效治療靶點。

1材料與方法

1.1標(biāo)本與細(xì)胞收集2014年3月～6月我院普通外科胃癌組織和對應(yīng)正常組織標(biāo)本各20例。其中男14例，女6例；年齡36～63歲，中位年齡53歲。胃癌標(biāo)本、對應(yīng)正常組織均得到病理證實。胃永生化正常上皮細(xì)胞GES，胃癌細(xì)胞AGS、MKN28、SGC7901、BGC823、MKN45均保存于我院。

1.2實驗耗材RPMI-1640、胎牛血清均購自美國Gibco公司。miR-217 mimics 和inhibitor均購自廣州銳博生物科技有限公司。Dual-luciferase檢測試劑盒購自美國Pormega公司。Transwell培養(yǎng)小室購于Corning公司。鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Sigma公司，兔抗人14-3-3ν抗體購于Cell signaling公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染取正常生長的SGC7901細(xì)胞，消化后重新接種到相應(yīng)的6孔板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000并參照其轉(zhuǎn)染步驟將NC或miR-217 mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染到SGC7901細(xì)胞中，終濃度為100 nmol/L，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基。

1.3.2RNA提取和qRT-PCR細(xì)胞經(jīng)過不同處理后，加入TRIzol充分裂解。每1 ml TRIzol加入0.3 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置15 min，4℃下12000 g離心15 min，小心轉(zhuǎn)移上層水相至新EP管中，加入05 ml異丙醇后混勻，4℃下12000 g離心20 min，棄上清，加入 1 ml 75 % 乙醇，洗滌RNA沉淀，4℃下12000 g 離心5 min；加入適量DEPC水溶解后于-80℃保存?zhèn)溆谩７崔D(zhuǎn)錄和qRT-PCR引物均購自廣州銳博公司。qRT-PCR采用莖環(huán)法SYBR green PCR mix(Takara)對miRNA進(jìn)行定量分析，所有反應(yīng)在8聯(lián)管中進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)采用三復(fù)孔；反應(yīng)體系為20 μl，包含SYBR Green PCR Master Mixture試劑10 μl，cDNA模版2 μl，上下游引物各0.8 μl，去離子水H2O 6.4 μl；擴(kuò)增程序：95℃，15 s；60 ℃，30 s；70 ℃，15 s，40個循環(huán)；U6為內(nèi)參。

1.3.3靶基因預(yù)測 使用Targetscan，PicTar，miranda等miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫共同預(yù)測，對靶基因3′-UTR區(qū)與miR-217種子序列進(jìn)行堿基互補(bǔ)比對并計算結(jié)合穩(wěn)定性，同時檢查該基因的miR-217結(jié)合區(qū)域是否具有保守型。

1.3.4雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炁c驗證構(gòu)建野生型全長14-3-3ν的3′UTR的質(zhì)粒，并通過定點突變技術(shù)構(gòu)建突變型載體。將NC或miR-217以及14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut載體共轉(zhuǎn)到胃癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入1 X PLB裂解液100 μl，裂解15 min，將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5 ml的EP管中， 4℃下10000 g離心5 min。轉(zhuǎn)移上清到新的EP管中待測。在EP管中加入LAR 底物40 μl，加入10 μl稀釋的上清，酶標(biāo)儀讀取Renilla熒光素酶的熒光值。加入終止試劑40 μl，立即讀取firefly熒光素酶熒光值。用比值計算各樣本熒光強(qiáng)度。

1.3.5Transwell實驗將轉(zhuǎn)染NC或miR-217 48 h后的SGC7901細(xì)胞消化計數(shù)，并用無血清的培養(yǎng)基重懸， 分別接種到平衡后的Insert小室中，下室的24孔板中加入含有10% FBS的培養(yǎng)基，37℃ 下培養(yǎng)24 h后取出。擦除未穿孔的上室細(xì)胞、甲醇固定15 min后0.1%結(jié)晶紫染色40 min，顯微鏡下觀察并計數(shù)。

1.3.6Western blotting法檢測轉(zhuǎn)移和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)細(xì)胞經(jīng)過不同處理后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度；每孔30 μg總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，半干轉(zhuǎn)至NC膜，5 %脫脂奶粉室溫封閉1h后，分別一抗(14-3-3ν，1∶1000；β-actin，1∶2000)4 ℃下孵育過夜。TBST漂洗后，再加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗后，采用化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.3.7裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗5～7 周齡雄性裸鼠，在恒溫恒濕環(huán)境下飼養(yǎng)。取穩(wěn)定表達(dá)miR-217或NC的Luciferase標(biāo)記的SGC7901細(xì)胞細(xì)胞，消化計數(shù)并調(diào)整濃度至 1×107個/ml，每只裸鼠尾靜脈注射 0.2 ml，每組接種7只，自接種日起每周觀察 1 次。7 周后，利用小動物成像系統(tǒng)觀察Luciferase信號強(qiáng)度。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析每次實驗至少重復(fù)三次，用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，均數(shù)的比較采用t檢驗，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1miR-217在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況我們首先通過qRT-PCR驗證miR-217在20對胃癌與對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)。結(jié)果表明，miR-217在胃癌組織中表達(dá)顯著高于對應(yīng)癌旁組織(P<0.05)(圖1 A)。同時，我們發(fā)現(xiàn)miR-217在多個胃癌細(xì)胞系的表達(dá)比永生化正常上皮細(xì)胞GES明顯下降(P<0.05)(圖1 B)。這些結(jié)果提示miR-217可能在胃癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。

圖1miR-217在胃癌和癌旁組織，胃癌細(xì)胞系和正常胃黏膜永生化細(xì)胞系中的表達(dá)情況

Figure 1miR-217 expression in gastric cancer, adjacent normal tissues, gastric cancer cell line and normal immortalized gastric epithelial cells

注：A.qRT-PCR檢測miR-217在20對胃癌及癌旁組織中的表達(dá)；B.qRT-PCR檢測miR-217在胃癌細(xì)胞系和正常胃癌上皮細(xì)胞中的表達(dá)

2.2miR-217過表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞遷移侵襲能力為明確miR-217在胃癌轉(zhuǎn)移中的作用，分別用miR-217 mimics或inhibitors上調(diào)或抑制其表達(dá)(圖2 A)，觀察對胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-217 mimics細(xì)胞中，遷移細(xì)胞數(shù)為(86±16)個/200倍視野，而NC組遷移細(xì)胞數(shù)(159±3)個/200倍視野，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而在SGC7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)入miR-217 inhibitors下調(diào)其表達(dá)，其遷移細(xì)胞數(shù)為(215±30)個/200倍視野，而NC組遷移細(xì)胞數(shù)(145±23)個/200倍視野，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)(圖2B、C)。

我們進(jìn)一步構(gòu)建了miR-217的慢病毒表達(dá)載體及其對照載體，并分別感染穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的SGC7901細(xì)胞，分別命名為LV-miR-217和LV-NC。qRT-PCR證實miR-217在穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中高表達(dá)(P<0.05)(圖2D)。取14只裸鼠，隨機(jī)分為2組后，通過尾靜脈注射分別建立胃癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移裸鼠模型。7周后，采用體內(nèi)成像系統(tǒng)，觀察胃癌轉(zhuǎn)移情況。發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射后LV-miR-217細(xì)胞的裸鼠中，Luciferase信號比LV-NC組明顯降低。在LV-NC組中，7只裸鼠僅有1只發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；而在LV-miR-217組中，有5只裸鼠發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶(P<0.05)(圖2 E)。這些結(jié)果表明，miR-217能夠明顯降低SGC7901細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。

2.314-3-3ν是miR-217的靶基因我們通過Targetscan等生物信息學(xué)軟件預(yù)測，發(fā)現(xiàn)14-3-3ν是miR-217的靶基因(圖3A)。我們構(gòu)建了野生型(wt)和突變型(mut)14-3-3ν熒光素酶報告基因載體。將14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut質(zhì)粒分別與miR-217質(zhì)粒、空載體(NC)共轉(zhuǎn)染，或單獨轉(zhuǎn)染(Vehicle) SGC7901細(xì)胞。48 h后檢測細(xì)胞的熒光素酶活性。結(jié)果顯示：14-3-3ν-wt與miR-217質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性為0.55±0.6，較NC組熒光素酶活性(1.0±0.10)和空白對照組熒光素酶活性(0.95±0.11)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陰性對照與空白對照相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而14-3-3ν-mut與miR-217共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性為0.95±0.05，與陰性對照組熒光素酶活性(0.94±0.09)和空白對照熒光素酶活性(0.98±0.09)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖3B)。這些結(jié)果提示miR-217過表達(dá)顯著抑制14-3-3ν-wt熒光素酶的活性；而對在14-3-3ν-mut的熒光素酶活性沒有明顯抑制作用。

Western blot結(jié)果顯示，SGC7901細(xì)胞過表達(dá)miR-217后，14-3-3ν的 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于NC(圖3C)。用 miR-217 的抑制劑下調(diào) GC9811 細(xì)胞中 miR-217 的表達(dá)時，14-3-3ν的mRNA和蛋白表達(dá)均升高，提示 miR-217 負(fù)性調(diào)控 14-3-3ν的表達(dá)。

我們將14-3-3ν-wt和14-3-3ν-mut的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入SGC7901細(xì)胞中，western blot檢測發(fā)現(xiàn)其14-3-3ν表達(dá)均明顯上調(diào)。轉(zhuǎn)染miR-217后，發(fā)現(xiàn)14-3-3ν-wt明顯能被miR-217抑制，然而3′-UTR突變的14-3-3ν-mut的表達(dá)并沒有被miR-217下調(diào)(圖3D)，說明miR-217通過作用于14-3-3ν的3′-UTR來抑制其表達(dá)。

3討論

本研究在胃癌中開展miR-217的功能探討，我們通過檢測miR-217在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)闡明了miR-217通過其下游靶基因14-3-3ν抑制胃癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為將miR-217作為胃癌的分子標(biāo)志物以及轉(zhuǎn)移靶向分子提供了重要依據(jù)。

圖2體內(nèi)外實驗表明miR-217能夠抑制胃癌轉(zhuǎn)移

Figure.2 miR-217 inhibited metastasis of gastric cancer both in vitro and in vivo

注：A.轉(zhuǎn)染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR檢測miR-217表達(dá)；B、C.Transwell檢測轉(zhuǎn)染miR-217 mimics或inhibitors對SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響；D.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-217或?qū)φ章《竞?，qRT-PCR檢測miR-217的表達(dá)情況；E.體內(nèi)轉(zhuǎn)移模型檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miR-217對SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

MicroRNA 通過作用于靶基因mRNA的3′非編碼區(qū)，抑制其翻譯或促進(jìn)其降解，在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)[2, 4, 7]。近來研究也證實microRNA參與了腫瘤發(fā)生和演進(jìn)的各個階段，如轉(zhuǎn)移、增殖和耐藥[8-10]。胃癌轉(zhuǎn)移涉及侵襲基膜、體內(nèi)播散、遠(yuǎn)端定殖等多個過程[2, 3]。miRNA作為基因的重要調(diào)控分子，參與轉(zhuǎn)移的各個步驟[10]。已有研究提示miR-217可能在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但先前的研究表明miR-217在不同的惡性腫瘤中所發(fā)揮的功能不一致[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)miR-217能夠靶向KRAS抑制胰腺癌生長[5]，miR-217還能夠靶向E2F3抑制肝癌轉(zhuǎn)移[6]，也有研究發(fā)現(xiàn)miR-217具有促癌作用[14]。本研究通過體內(nèi)外實驗都證明miR-217的過表達(dá)能引起胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的下降，進(jìn)一步通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-217通過靶向14-3-3ν抑制胃癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。miR-217的作用可能并非僅集中在抑制侵襲轉(zhuǎn)移方面，可能在多種胃癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮作用，還有待更多的實驗證明。14-3-3家族分子在腫瘤中具有重要作用[15-17]，其中，14-3-3ν是14-3-3家族中的重要成員，在肺癌、乳腺癌中高表達(dá)，并與患者預(yù)后相關(guān)[16, 17]。在肺癌中，14-3-3ν受到p53的抑制。當(dāng)p53缺失時，14-3-3ν表達(dá)增高，可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[16, 18]。本研究率先發(fā)現(xiàn)miR-217能夠直接靶向14-3-3ν，抑制胃癌轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果提示，14-3-3ν發(fā)揮了癌基因的作用，在胃癌等多種腫瘤的惡性生物學(xué)表型的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

圖314-3-3ν是miR-217的靶基因

Figure 314-3-3ν is a target gene of miR-217

注：A。生物信息學(xué)分析miR-217與14-3-3ν的結(jié)合位點；B.SGC7901細(xì)胞分別共轉(zhuǎn)染Luc-14-3-3ν-wt或Luc-14-3-3ν-mut和NC或miR-217后，檢測相對Luciferase熒光值。分別轉(zhuǎn)染miR-217 mimics或inhibitors之后，qRT-PCR檢測miR-217的表達(dá)情況；C.SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-217 mimics或inhibitors后，14-3-3ν mRNA和蛋白的表達(dá)情況；D.SGC7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染14-3-3ν-wt或14-3-3ν-mut，或同時轉(zhuǎn)染miR-217 mimics后，檢測14-3-3ν的蛋白表達(dá)

4結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)miR-217/ 14-3-3ν這一抑制胃癌轉(zhuǎn)移的重要通路，為胃癌靶向治療提供了新的潛在靶點。通過恢復(fù)miR-217的表達(dá)或抑制14-3-3ν的表達(dá)，有可能提高胃癌轉(zhuǎn)移的治療效果。

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miR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν

LEI Wei,DENG Mingming

(DepartmentofDigestiveDiseases,SichuanMedicalUniversity,Luzhou646000,Sichuan,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role and mechanisms of miRNA-217 (miR-217) in inhibition of gastric cancer metastasis. MethodsqRT-PCR was used to evaluate miR-217 expression between gastric cancer tissues and paired adjacent tissues, gastric cancer cell lines and normal gastric epithelial cells. After transfection of miR-217 mimics or Inhibitors, transwell invasion assay was applied to the effect of miR-217 in gastric cancer cell metastasis; metastasis model in nude mice was used to observe the effect of miR-217 overexpression in metastasis of gastric cancer in vivo; Bioinformatics analysis revealed 14-3-3ν as a candidate target genes of miR-217. Luciferase activity of the luciferase reporter assay was used to detect the effect of miR-217 on wild-type and mutant 14-3-3ν in SGC7901 cells. Western blot was used to evaluate whether miR-217 affect protein expression of 14-3-3ν and its mutant. ResultsThe expression of miR-217 in gastric cancer tissues was significantly decreased, compared with adjacent normal tissues (P<0.01). miR-217 expression level in the gastric cancer cells was significantly reduced, compared with normal gastric epithelial cell GES (P<0.01). MiR-217 mimics significantly inhibited invasion of SGC7901 cells, compared with the negative control (P<0.01). While miR-217 inhibitors significantly promoted invasion of SGC7901 cells (P<0.01); stable expression of miR-217 in SGC7901 cells demonstrated a reduced invasion capacity in vivo. Luciferase reporter assay showed that miR-217 inhibited luciferase activity of 14-3-3ν by targeting its 3′-UTR region; Western blot assay showed SGC7901 cells transfected with miR-217 significantly decreased 14-3-3ν expression, compared with the negative control. Western blotting showed that overexpression of miR-217 significantly inhibited the expression of14-3-3ν-wt, but not 14-3-3ν-mut. Conclusion MiR-217 inhibits gastric cancer metastasis by targeting 14-3-3ν. Restore of miR-217 expression or 14-3-3ν inhibition may be effective for the treatment of gastric cancer metastasis.

【Key words】Gastric cancer; Metastasis; miRNA; miR-217; 14-3-3ν

(收稿日期：2015-09-27； 編輯： 何興華)

【中圖分類號】R 735.2

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.04.003

通訊作者：雷微，E-mail：hileiwei@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(30973422)