李小云, 趙喜玲, 李 琪, 宋丹萍, 曾 慧, 張 宏,*

( 1. 四川師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610066; 2. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101; 3. 四川師范大學(xué) 植物資源開發(fā)與應(yīng)用研究所, 四川 成都 610101; 4. 四川省眉山市動(dòng)物疾病控制中心, 四川 眉山 620010)

食品中10種色素的高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)方法

李小云1, 趙喜玲1, 李 琪2,3, 宋丹萍4, 曾 慧2, 張 宏1,2*

( 1. 四川師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610066; 2. 四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 四川 成都 610101; 3. 四川師范大學(xué) 植物資源開發(fā)與應(yīng)用研究所, 四川 成都 610101; 4. 四川省眉山市動(dòng)物疾病控制中心, 四川 眉山 620010)

采用高效液相色譜法建立食品中10種黃色色素的檢測(cè)方法.甲醇作為溶劑對(duì)飲料、糖果、糕點(diǎn)3類樣品進(jìn)行提取,甲醇(A)-0.02 mol/L乙酸銨溶液(B)-乙腈(C)為流動(dòng)相,Macherey-Nagel C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)為固定相,柱溫25 ℃,流速1.0 mL/min,波長(zhǎng)435 nm,進(jìn)樣量20 μL.結(jié)果顯示,10種色素的線性范圍為0.25～160.0 μg/mL,飲料、糖果、糕點(diǎn)樣品中各色素的加標(biāo)回收率分別在88.0%～103.6%、88.0%～98.3%、81.4%～106.7%之間.該方法重現(xiàn)性好,靈敏度和準(zhǔn)確度高,適用于食品中該10種黃色色素的分析.

食用色素; 非食用色素; 高效液相色譜

在食品加工業(yè)中通常加入各種色素以提高食品的色澤,增加食欲.色素按其用途可分為食用色素和非食用色素.大部分食品中使用較多的是黃色色素.色素使用過(guò)程中添加過(guò)量、違規(guī)添加等現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,某些色素過(guò)量攝入會(huì)危害健康[1].因此,食品中色素的分析測(cè)定顯得尤為重要.

色素的檢測(cè)方法主要是液相色譜法[2-4]以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)[5-6].N. Yoshioka等[7]報(bào)道了食品中合成色素的檢測(cè)方法,其中大部分為非食用色素.目前檢測(cè)食品中合成色素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),基本以聚酰胺吸附法為樣品前處理方法[8-9],而非食用色素的檢測(cè)尚未有較為全面的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).由于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法《食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè)——堿性橙染料》[10]僅規(guī)定了堿性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22的分析測(cè)定;因此,針對(duì)非食用色素的分析檢測(cè)還不完善.文獻(xiàn)報(bào)道的色素處理方法較為繁雜,而能將樣品前處理簡(jiǎn)單化,并且能同時(shí)檢測(cè)含有天然色素、合成色素和非食用黃色色素的液相色譜方法研究較少.本文將允許添加的合成黃色色素檸檬黃、日落黃以及喹啉黃、天然色素姜黃素和非食用色素酸性間胺黃、堿性嫩黃O、堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、酸性橙Ⅱ等10種黃色色素作為研究對(duì)象,建立一種能同時(shí)檢測(cè)多種色素的高效液相色譜法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器 檸檬黃(CAS:1934-21-0)、日落黃(CAS:2783-94-0)、酸性間胺黃(CAS:587-98-4)均購(gòu)于AccuStandard公司,喹啉黃(CAS:8004-92-0)、姜黃素(CAS:458-37-7)、酸性橙Ⅱ(CAS:633-96-5)、堿性嫩黃O(CAS:2465-27-2)均購(gòu)于Dr.Ehrenstorfer GmbH公司,堿性橙2(CAS:532-82-1)、堿性橙21(CAS:3056-93-7)、堿性橙22(CAS:4657-00-5)購(gòu)于北京振翔工貿(mào)有限公司,甲醇、乙腈(均為色譜純)購(gòu)于美國(guó)BRC公司,其余試劑(分析純)購(gòu)于科密歐試劑有限公司.

PDA-100液相色譜儀(美國(guó)戴安公司),Direct-Q 5型超純水儀(美國(guó)Millipore公司),Buchi R-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)賽多利斯公司).

1.2 色譜條件 色譜柱:Macherey-Nagel C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:25 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):435 nm;流動(dòng)相:甲醇(A)、0.02 mol/L乙酸銨溶液(B)、乙腈(C);各流動(dòng)相梯度洗脫的體積分?jǐn)?shù)見表1.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 準(zhǔn)確稱取各色素標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg于25 mL容量瓶中,甲醇溶解并定容,作為質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的各單色素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,待用.取各單標(biāo)色素的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液4 mL至50 mL容量瓶,甲醇定容,得到質(zhì)量濃度160 μg/mL混合儲(chǔ)備液,待用.

表 1 各流動(dòng)相梯度洗脫的體積分?jǐn)?shù)

1.3.2 樣品溶液制備 稱取飲料樣品20.0 g,旋至近干,加入20 mL甲醇,超聲20 min,離心15 min,取上層清液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè).

糖果樣品稱取2.5 g,超純水加熱溶解后,加入10 mL甲醇,超聲30 min,離心15 min,取上層清液,剩余殘?jiān)貜?fù)上述操作1次,合并2次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至20 mL,溶液過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè).

糕點(diǎn)、冰淇淋樣品稱取2.5 g,先加入10 mL石油醚,充分?jǐn)嚢韬蟮钩鋈芤?再向殘?jiān)尤? mL石油醚,攪拌后除去油脂干燥.再向樣品中加入30 mL甲醇,超聲20 min,離心15 min,取上層清液,剩余殘?jiān)貜?fù)上述操作2次,合并3次提取液旋蒸至近干,甲醇定容至10 mL,溶液過(guò)0.45 μm濾膜,待測(cè).

1.3.3 線性范圍的建立 取一定體積的混標(biāo)儲(chǔ)備液分別配制成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、100.0、160.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液,在1.2色譜條件下進(jìn)行分別測(cè)定.

1.3.4 精密度的考察 分別取0.25、10和100 μg/mL低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)平行測(cè)定6次.

1.3.5 穩(wěn)定性的考察 飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品各取1份,分別加入低質(zhì)量濃度0.25 μg/mL混標(biāo)液,樣品按1.3.2項(xiàng)方法處理后,按1.2所述色譜條件分別在0、6、12、24和48 h進(jìn)樣分析.

1.3.6 重現(xiàn)性的考察 各取飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品6份,分別加入質(zhì)量濃度0.25 μg/mL的混合標(biāo)液,按1.3.2項(xiàng)方法制備樣品溶液,按1.2項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析,測(cè)定峰面積,計(jì)算出10種色素的質(zhì)量濃度及RSD值.

1.3.7 回收率的測(cè)定 分別稱取9份飲料樣品20.0 g、糖果樣品2.5 g和糕點(diǎn)樣品2.5 g,根據(jù)1.3.2項(xiàng)樣品處理,飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品中添加0.25、10和40 μg/mL的低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液.按1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定,計(jì)算9次的平均回收率.

1.4 樣品的測(cè)定 分別準(zhǔn)確稱取2.50 g的糖果和糕點(diǎn)樣品,稱取20.0 g飲料樣品.按1.3.2所述的前處理方法和1.2所述色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行提取和色譜分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 分別對(duì)10種色素在波長(zhǎng)190～800 nm范圍內(nèi)采集紫外光譜圖,其中日落黃、酸性橙Ⅱ、堿性橙21、堿性橙22等4種色素的最大吸收波長(zhǎng)在490 nm左右,同時(shí)在430 nm左右也都有一定的紫外吸收,其余6種色素的最大吸收波長(zhǎng)均在430 nm左右,綜合各種色素的最大吸收波長(zhǎng),最后選擇435 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),在此波長(zhǎng)下每個(gè)色素均能被檢測(cè).

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)選擇比較了甲醇-水體系、甲醇-緩沖鹽體系共5種溶液.結(jié)果發(fā)現(xiàn):流動(dòng)相僅使用甲醇-水溶液時(shí),10種色素很難完全分離;使用甲醇-乙酸銨溶液作為流動(dòng)相時(shí),10種色素能實(shí)現(xiàn)基本分離;但堿性橙21、酸性橙Ⅱ和堿性橙2等3種色素保留時(shí)間較接近.當(dāng)加入少量乙腈時(shí),分離效果更好,堿性橙21和酸性橙Ⅱ能實(shí)現(xiàn)完全分離.故選擇甲醇-乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液組成流動(dòng)相體系.

2.1.3 pH的選擇 試驗(yàn)分別比較了10種色素在pH=5.0、7.1、5.8時(shí)的分離情況.結(jié)果表明:在pH=5.8時(shí),10種組分分離效果較理想;在pH=5.0時(shí),日落黃、檸檬黃不能被很好地洗脫下來(lái),部分色譜峰完全重疊;在pH=7.1時(shí),喹啉黃與雜質(zhì)峰完全重疊,堿性嫩黃O與堿性橙21、堿性橙21與酸性橙Ⅱ、堿性橙22與姜黃素不能達(dá)到完全分離.故選取pH=5.8的0.02 mol/L乙酸銨溶液.

2.1.4 流速的選擇 試驗(yàn)分別考察流速為0.8、1.0、1.2 mL/min時(shí)10種混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰情況.當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí),堿性橙21和酸性橙Ⅱ之間未能實(shí)現(xiàn)完全分離;流速為1.0 mL/min時(shí),各組分之間均能實(shí)現(xiàn)完全分離,且分離度大于1.5;流速為1.2 mL/min時(shí),堿性橙21和酸性橙Ⅱ分離度未達(dá)到1.5以上.綜合考慮最終確定流速為1.0 mL/min.

2.1.5 柱溫的選擇 本試驗(yàn)分別考察了20、25、30 ℃對(duì)10種色素分離情況的影響.結(jié)果表明:柱溫在20 ℃時(shí)酸性橙Ⅱ和堿性橙2分離度未能達(dá)到1.5以上.柱溫為25 ℃時(shí),各組分均能實(shí)現(xiàn)完全分離,分離度在1.6以上.柱溫在30 ℃時(shí),堿性橙21與酸性橙Ⅱ色譜峰完全重疊,堿性橙2包含雜質(zhì)峰.綜合考慮選擇最適宜的柱溫為25 ℃.

2.2 方法學(xué)的驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍的建立 在選定的最佳條件下,10種色素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限(S/N=3)、定量限(S/N=10)見表2.該10種色素在質(zhì)量濃度0.25～160 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

表 2 10種色素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(n=3)

2.2.2 精密度 10種色素的標(biāo)準(zhǔn)溶液在1.2色譜條件下測(cè)定峰面積,計(jì)算RSD值,10種色素的RSD值均小于5%;結(jié)果表明精密度良好.

2.2.3 穩(wěn)定性 按1.2所述色譜條件分別在0、6、12、24、48 h進(jìn)樣分析.結(jié)果表明:飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品中色素的質(zhì)量濃度隨時(shí)間無(wú)明顯變化,表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

2.2.4 重復(fù)性 按1.2所述色譜條件進(jìn)行分析,飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品中色素的RSD值在1.5%～4.9%范圍內(nèi)(n=6),結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好.

2.2.5 回收率的測(cè)定 按1.2項(xiàng)色譜條件平行測(cè)定3次,計(jì)算各樣品的回收率.飲料、糖果、糕點(diǎn)樣品中各色素的加標(biāo)回收率分別在88.0%～103.6%、88.0%～98.3%、81.4%～106.7%之間.結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)方法數(shù)據(jù)準(zhǔn)確,此方法可行.

2.3 樣品處理方法的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇 試驗(yàn)選取了甲醇、甲醇-丙酮、乙腈-正己烷、乙醇-氨水-水(質(zhì)量濃度比為：80∶1∶19,下同)4種提取溶劑作為比較.考察加入混標(biāo)的飲料樣品均能提取出色素.其中甲醇和乙醇-氨水-水的提取效果比甲醇-丙酮、乙腈-正己烷好,樣品經(jīng)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)甲醇溶劑能把10種色素全部提取出來(lái),并且雜峰少;乙醇-氨水-水溶劑提取出的色素在檸檬黃的保留時(shí)間處有干擾峰.

考察含有混標(biāo)的糖果樣品,甲醇和乙醇-氨水-水溶劑提取效果較為理想,其中甲醇提取的10種色素能實(shí)現(xiàn)較好的分離.乙醇-氨水-水提取的色素,未檢測(cè)到姜黃素,且酸性橙Ⅱ和堿性橙的峰重疊.

考察加入混標(biāo)的糕點(diǎn)樣品時(shí),甲醇和甲醇-丙酮溶劑提取后,溶液澄清,經(jīng)檢測(cè)甲醇-丙酮提取溶劑的提取效果比甲醇溶劑的提取效果稍差.綜合考慮,本實(shí)驗(yàn)選取甲醇作為飲料、糖果、糕點(diǎn)樣品的提取溶劑.

2.3.2 提取體積的考察 實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取溶劑,當(dāng)飲料樣品提取體積為20 mL時(shí),提取的檸檬黃質(zhì)量濃度最高.提取體積逐漸增大時(shí),其質(zhì)量濃度有所降低.糖果樣品中檸檬黃的提取量隨提取體積的增加呈下降趨勢(shì).糕點(diǎn)樣品在提取體積增加到30 mL時(shí),提取效果明顯增加;繼續(xù)增大提取體積時(shí),提取結(jié)果有所下降.綜合考慮,飲料、糖果樣品的提取體積為20 mL,糕點(diǎn)樣品的提取體積為30 mL,結(jié)果見圖1.

2.3.3 提取次數(shù)的考察 實(shí)驗(yàn)分別考察了1～4次不同提取次數(shù)對(duì)添加有檸檬黃色素的飲料、糖果和糕點(diǎn)3種樣品提取效果的影響,結(jié)果見圖2.結(jié)果表明飲料樣品的提取效果隨提取次數(shù)增加呈小幅下降.糖果樣品分別提取2和3次,提取的檸檬黃質(zhì)量濃度基本一致,當(dāng)增加到提取4次后,檸檬黃質(zhì)量濃度降低;糕點(diǎn)樣品隨著提取次數(shù)增加呈上升狀態(tài),當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次以上,檸檬黃質(zhì)量濃度不再增加.故飲料樣品提取1次,糖果樣品提取2次,糕點(diǎn)樣品提取3次.

2.3.4 提取時(shí)間的考察 實(shí)驗(yàn)考察了10、20、30和40 min不同提取時(shí)間對(duì)添加有檸檬黃色素的飲料、糖果和糕點(diǎn)樣品提取效果的影響,結(jié)果見圖3.當(dāng)飲料和糕點(diǎn)樣品提取時(shí)間為20 min時(shí),檸檬黃質(zhì)量濃度達(dá)到最大值,此后隨時(shí)間的增加而減小.糖果樣品中檸檬黃質(zhì)量濃度隨提取時(shí)間的增加呈先增大后減小的趨勢(shì),當(dāng)提取時(shí)間為30 min時(shí)檸檬黃達(dá)到最大值.因此,確定飲料和糕點(diǎn)樣品的提取時(shí)間為20 min,糖果樣品為30 min.

2.4 樣品測(cè)定及結(jié)果 在最佳實(shí)驗(yàn)條件下,對(duì)樣品進(jìn)行分析測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4.飲料、糖果、糕點(diǎn)樣品檢測(cè)結(jié)果表明,碳酸飲料基本都含有檸檬黃和日落黃色素中的1種或2種,小部分果蔬汁飲料檢測(cè)含有少量檸檬黃或日落黃.絕大多數(shù)糖果含有檸檬黃,糕點(diǎn)樣品的餡兒料中多添加有檸檬黃或日落黃2種人工合成色素,樣品中均未檢測(cè)到超標(biāo)或違法添加非食用色素的產(chǎn)品.

3 討論

本文在實(shí)驗(yàn)中選用Kromasil C18柱、Macherey-Nagel C18色譜柱進(jìn)行比較.2種色譜柱初始時(shí)都能對(duì)10種色素實(shí)現(xiàn)良好地分離,但Kromasil C18色譜柱使用一段時(shí)間后柱效明顯下降,而Macherey-Nagel C18色譜柱則表現(xiàn)出良好的性能,并且各色素之間的分離度良好,故選擇Macherey-Nagel C18色譜柱.

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[10] 食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè)-堿性橙染料高效液相色譜法:GB/T 23496—2009[S]. 北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009.

(編輯 余 毅)

Simultaneous Determination of 10 Pigments in Food Samples by HPLC

LI Xiaoyun1, ZHAO Xiling1, LI Qi2,3, SONG Danping4, ZENG Hui2, ZHANG Hong1,2

( 1. College of Chemistry and Materials Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610066, Sichuan; 2. College of Life Science, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan; 3. Development and Application Institute of Plant Resources, Sichuan Normal University, Chengdu 610101, Sichuan; 4. Meishan Center for Animal Disease Prevention and Control, Meishan 620010, Sichuan)

To establish a method for simultaneous determination 10 kinds of yellow pigments in food with high performance liquid chromatography (HPLC). The pigments were extracted with methanol from drinks, candy and cake samples. The HPLC detection conditons were methanol (A), 0.02 mol/L ammonium acetate solution (B), acetonitrile (C) as the mobile phase gradient, Macherey-Nagel C18 column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) as the stationary phase, column temperature 25 ℃, the flow rate 1.0 mL/min, detection wavelength 435 nm, injection volume 20 μL. The linear range of 10 kinds of pigment were 0.25～160.0 μg/mL, and the recoveries in drinks, candy, cakes samples were 88.0%～103.6%, 88.0%～98.3%, 81.4%～106.7%. This method showed good reproducibility, sensitivity and accuracy and it could be applied for determination of 10 kinds of yellow pigments in food.

food coloring; non-food coloring; HPLC

2016-01-03

四川省教育廳青年基金(2006B035)和四川省攀枝花市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目(2008CY-S-1)

O657.72

A

1001-8395(2016)06-0895-05

10.3969/j.issn.1001-8395.2016.06.022

*通信作者簡(jiǎn)介:張 宏(1965—),女,教授,主要從事天然產(chǎn)物開發(fā)與應(yīng)用的研究,E-mail:Zhanghong651@aliyun.com